參姜鎖陽(yáng)益氣片對(duì)寒凝氣滯血瘀證大鼠腦組織中ATP酶和核苷酸的影響

賈丹兵，鞏沅鑫，李乃民，唐立明，李春杰，劉 珊，魏 博

血瘀證是指血液循環(huán)遲緩，或流行不暢，甚則血液瘀結(jié)停滯成積的病理狀態(tài)，于我國(guó)東北地區(qū)常見(jiàn)，長(zhǎng)期困擾人們的工作和生活。我們根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，對(duì)寒凝氣滯血瘀證這一病癥的某些特征進(jìn)行模擬復(fù)制，創(chuàng)造出具有人工疾病和證的動(dòng)物模型，并應(yīng)用自主研發(fā)的參姜鎖陽(yáng)益氣片對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行治療，探討參姜鎖陽(yáng)益氣片對(duì)寒凝氣滯血瘀證大鼠模型腦組織中ATP酶和核苷酸的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備 選取清潔級(jí)SD大鼠［由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào) SCXK(黑)2008004］60只，雄性，體重(200±20)g。隨機(jī)選取12只大鼠作為A組，其余48只采用腎上腺素加冰水浴復(fù)合低溫冷凍法，建立寒凝氣滯血瘀證大鼠模型［1-2］。方法如下:大鼠在第1天先采用皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素0.08 ml/100 g，共注射2次，間隔4 h，第1次注射給藥后2 h將大鼠置于4℃冰水浸泡5 min;于第2天將大鼠分別放入低溫冷柜小鼠籠中，在-20℃的冷環(huán)境中持續(xù)受凍4 h，每日1次，連續(xù)7次，造模成功后隨機(jī)分為B、C、D、E 組，每組12只。

1.2 方劑成分及劑量的確定 參姜鎖陽(yáng)益氣片(由解放軍211醫(yī)院提供，批號(hào):20100702)，成分為西洋參、桂枝、紅花、干姜、鎖陽(yáng)等［3］。組方劑量根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2005版規(guī)定的劑量要求和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)的擬用劑量來(lái)確定。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 造模結(jié)束后第2天開(kāi)始，C、D、E組按體重計(jì)算分別應(yīng)用不同濃度，相同體積的參姜鎖陽(yáng)益氣片水溶液灌胃給藥，給藥劑量分別為70、140、280 mg/kg，A、B組給予等體積的生理鹽水。每天1次，連續(xù)給藥14 d。給藥結(jié)束后第2天，各組大鼠應(yīng)用戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速開(kāi)胸暴露心臟，從左心室插管至升主動(dòng)脈根部，在右心耳剪開(kāi)一小口做出口。4℃生理鹽水200 ml快速灌注，之后稍減慢灌注速度沖洗至流出液清亮，大鼠斷頭后快速于冰盤上取出全腦，分離出海馬和下丘腦，迅速放入液氮中備用。

1.3.1 ATP酶活力檢測(cè):將分離出的一半腦組織樣品放入研磨器中，加入液氮并研成精細(xì)的粉末，待液氮揮發(fā)后稱重，以10倍體積的生理鹽水溶解，在冰浴下制備成組織勻漿液，3500 r/min離心10 min，取上清液，應(yīng)用南京建成生物工程研究所提供的ATP酶測(cè)試盒進(jìn)行酶活力測(cè)定，將100μl上清液加入130μl反應(yīng)液中，混勻，37℃水浴10 min后，加入鉬酸銨50 μl，混勻，3000 ～4000 r/min離心10 min，取100μl上清液加入2000μl定磷劑定磷。45℃水浴20 min，冷卻至室溫后，在660 nm波長(zhǎng)下，1 cm光徑，分光光度法比色。

1.3.2 核苷酸活性測(cè)定:將另一半腦組織樣品放入研磨器中，加入液氮并研成精細(xì)的粉末，待液氮揮發(fā)后稱重，以 10倍體積的 Tris-HCL緩沖液(0.05 mol/L，pH=7.4)溶解，在冰浴下制備成組織勻漿液，3500 r/min離心10 min，取上清液，應(yīng)用雙抗體夾心(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)檢測(cè)腦組織中環(huán)腺甘酸(cAMP)、環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)、腺苷酸環(huán)化酶(AC)、磷酸二酯酶(PDE)濃度。AC活性測(cè)定的cpm值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可算出每分鐘每毫克組織分解ATP生成cAMP的量為其活性單位［pmol/(mg·min)］。PDE活性測(cè)定用每分鐘每毫克組織水解3H-cAMP的百分轉(zhuǎn)化率表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 ATP酶活力 與A組比較，B組海馬區(qū)和下丘腦組織中 Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力均降低(P＜0.05);與B組比較，除C組下丘腦Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP和 D 組下丘腦Na+-K+-ATP酶活力外，C、D、E組海馬區(qū)及下丘腦組織ATP酶活力均不同程度升高，且呈劑量依賴性，以E組變化最明顯(P＜0.05，P＜0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 核苷酸活性 與A組比較，B組海馬和下丘腦組織中cAMP、cGMP、AC活性降低，PDE活性升高(P＜0.05);與 B組比較，除 C組海馬區(qū) cAMP、cGMP和下丘腦組織中cAMP外，C、D、E組海馬和下丘腦cAMP、cGMP、AC均升高，PDE活性均降低，且呈劑量依賴性，以E組變化最明顯(P＜0.05，P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表1 5組大鼠海馬及下丘腦組織中ATP酶活力變化(x ± s，n=12)

表2 5組大鼠海馬及下丘腦組織中核苷酸活性變化(x ± s，n=12)

3 討論

當(dāng)外界溫度過(guò)低超過(guò)人體的生理調(diào)節(jié)能力或人體在寒冷環(huán)境中暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，寒冷刺激可以導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)遲鈍、身體疲勞，使體能消耗與作業(yè)效能降低同時(shí)并存。Ca2+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Na+-K+-ATP是廣泛存在于各類細(xì)胞細(xì)胞膜上的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其正常的生理活動(dòng)對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)外各種離子不同的濃度梯度至關(guān)重要［4-8］。當(dāng)這些膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能受損時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激性和傳導(dǎo)性下降，無(wú)法及時(shí)、準(zhǔn)確地將上游神經(jīng)中樞的控制信號(hào)傳遞給效應(yīng)器，同時(shí)，也無(wú)法將感受器接收到的各種刺激信號(hào)上傳至各級(jí)神經(jīng)中樞，使機(jī)體無(wú)法迅速對(duì)外界刺激作出相應(yīng)的反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致一系列病理現(xiàn)象的發(fā)生。cAMP、cGMP作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使廣泛參與細(xì)胞內(nèi)多種生理、生化反應(yīng)和細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)［9-13］，其含量變化受AC和PDE活性的雙重調(diào)節(jié)。cAMP和cGMP是AC分別催化ATP和GTP脫去一個(gè)焦磷酸后的產(chǎn)物，且cAMP與cGMP能夠被PDE 迅速水解為無(wú)活性的 5＇-AMP 與 5＇-GMP［8］，進(jìn)而失去信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。當(dāng)cAMP、cGMP含量發(fā)生改變時(shí)，導(dǎo)致下游信號(hào)蛋白PKA的激活作用減弱，進(jìn)而影響下游絲氨酸、蘇氨酸殘基的磷酸化激活或鈍化，影響機(jī)體相關(guān)調(diào)控信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)各種病理狀態(tài)。

參姜鎖陽(yáng)益氣片主要由西洋參、淫羊藿、鎖陽(yáng)、桂枝、干姜、紅花等組成，具有補(bǔ)脾、益腎、溫肺、強(qiáng)二本、聚宗氣、溫五臟、耐寒冷、增體力、旺精神之功效，使人體五臟六腑整體功能增強(qiáng)，提高人體正氣，增強(qiáng)免疫功能，防止臟腑器官功能減退。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與A組比較，B組腦組織中Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP 酶和 AC的活力顯著下降，cAMP和cGMP含量減少，PDE轉(zhuǎn)化率明顯升高。這可能是由于寒凝氣滯血瘀狀態(tài)下，機(jī)體氣血運(yùn)行不暢，甲狀腺、腎上腺皮質(zhì)功能降低，內(nèi)分泌激素作用于AC，使AC活化功能降低，導(dǎo)致cAMP和cGMP生成受阻，進(jìn)而影響機(jī)體的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能［14］。本研究結(jié)果還顯示，與B組比較，參姜鎖陽(yáng)益氣片能夠有效提高腦組織中Ca2+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Na+-K-+-ATP 酶活力及大鼠腦組織中cAMP和cGMP含量，增強(qiáng)AC活力，降低PDE轉(zhuǎn)化率，提示參姜鎖陽(yáng)益氣片能使細(xì)胞內(nèi)外各種離子濃度差向正常狀態(tài)恢復(fù)，增強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)激性和傳導(dǎo)性，使cAMP和cGMP活性提高并恢復(fù)及其下游信號(hào)功能，從而起到腦保護(hù)的作用。

綜上所述，參姜鎖陽(yáng)益氣片能夠有效治療因寒凝氣滯血瘀證所導(dǎo)致的機(jī)體應(yīng)激功能失調(diào)，恢復(fù)腦部離子通道功能，提高細(xì)胞內(nèi)重要信使分子cAMP和cGMP活性，使腦細(xì)胞保持功能活躍狀態(tài)，起到腦保護(hù)的作用。

［1］ 賈丹兵，于淼，李乃民，等.寒凝氣滯血瘀證大鼠動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)［J］.中醫(yī)藥信息，2014，31(4):74-77.

［2］ 田金洲，王永炎，徐意，等.血瘀證動(dòng)物模型的種類、評(píng)價(jià)與研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，29(6):396-400.

［3］ 賈丹兵，李乃民.疲勞學(xué)［M］.北京:學(xué)苑出版社，2008:351-355.

［4］ 秦潮.鈉鉀泵主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)理，功能與臨床［J］.中級(jí)醫(yī)刊，1984，11:27-29.

［5］ 史文靜，周華，戎靖楓，等.中藥補(bǔ)腎方對(duì)心力衰竭大鼠Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和琥珀酸脫氫酶的作用研究［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2012，18(6):544-547.

［6］ 范穎，李楠，孫云峰，等.黃芪有效部位對(duì)糖尿病大鼠Na+-K+-ATP酶活性及AMPK蛋白表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(10):2660-2663.

［7］ 王繹，張斌，李邦翅，等.間歇性低氧及運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響［J］.武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，18(7):597-600，611.

［8］ 王玉琳，金澤，孫忠人.針刺對(duì)D-gal致衰老大鼠模型腦組織 NO、NOS及 Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響［J］.針灸臨床雜志，2011，27(8):52-54.

［9］ G.克勞斯.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控的生物化學(xué)［M］.孫超，譯.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:97-99.

［10］黃文林，朱孝峰.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與疾病［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2012:85-87.

［11］陳向榮，蔣暉，游四維，等.cAMP誘導(dǎo)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生［J］.中華骨科雜志，2005，25(5):306-310.

［12］陳林，趙玉男，戴建國(guó)，等.海馬cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白與抗抑郁治療［J］.生理學(xué)報(bào)，2010，62(6):489-494.

［13］王正朝，石放雄.PDE4與cAMP信號(hào)區(qū)域化［J］.科學(xué)通報(bào)，2006，51(22):2577-2586.

［14］李敏，張冰，劉小青，等.虛寒狀態(tài)下cAMP變化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2010，17(2):33-34.