長型雙歧桿菌、糞腸球菌發(fā)酵培養(yǎng)改進(jìn)的研究

蔣潔倩

（上海信誼藥廠有限公司，上海 201206）

0 引言

通過在培菲康菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加微量元素和促生因子，可較為有效地提高培菲康菌種的發(fā)酵得率。根據(jù)《生物制品生產(chǎn)工藝過程變更管理技術(shù)指導(dǎo)原則》規(guī)定，改變發(fā)酵培養(yǎng)基物料需進(jìn)行補(bǔ)充申請(qǐng)，而整個(gè)補(bǔ)充申請(qǐng)的流程和獲批時(shí)間較長，作為我公司的重點(diǎn)產(chǎn)品，對(duì)培菲康原料工藝的改進(jìn)應(yīng)未雨綢繆，盡早展開。根據(jù)藥研所和車間的前期研究，作為培菲康原料主要菌種的長型雙歧桿菌（BL）、糞腸球菌（SF）在略微變動(dòng)發(fā)酵培養(yǎng)基的情況下，可通過增加微量元素的方法優(yōu)化原料生產(chǎn)工藝。

因此，建議對(duì)培菲康原料菌粉的發(fā)酵工藝進(jìn)行改進(jìn)，以實(shí)現(xiàn)培菲康發(fā)酵工藝改進(jìn)預(yù)期目標(biāo)（表1）中長型雙歧桿菌活菌量不降低、凍干菌粉重量增加的目標(biāo)。本文將從發(fā)酵培養(yǎng)基改良、凍干保護(hù)劑改進(jìn)、發(fā)酵參數(shù)控制等方面，對(duì)長型雙歧桿菌、糞腸球菌發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行研究與探討。

表1 培菲康發(fā)酵工藝改進(jìn)預(yù)期目標(biāo)

1 發(fā)酵培養(yǎng)基改良

因改變發(fā)酵培養(yǎng)基物料需進(jìn)行補(bǔ)充申請(qǐng)，而整個(gè)補(bǔ)充申請(qǐng)獲批時(shí)間較長，為盡快突破原料的產(chǎn)能瓶頸，故在改進(jìn)產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目中未對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基物料種類進(jìn)行更改，僅對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的配比進(jìn)行了改進(jìn)優(yōu)化，調(diào)整了碳氮比以更加利于長型雙歧桿菌和糞腸球菌的生長。從發(fā)酵理論可知，營養(yǎng)過于豐富對(duì)菌體的代謝、產(chǎn)物的合成及氧的傳遞都會(huì)產(chǎn)生不良的影響。若產(chǎn)生阻遏作用的碳源用量過大，則菌體生長受到明顯抑制；反之，僅僅供給維持量的碳源用量，菌體生長和產(chǎn)物合成就都停止。例如，當(dāng)葡萄糖濃度較低時(shí)不會(huì)出現(xiàn)抑制作用，而當(dāng)葡萄糖濃度較高時(shí)，則多數(shù)微生物不能生長，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)脫水現(xiàn)象。若采用增加乳糖含量的方式，可有效提高糞腸球菌培養(yǎng)基物料中的碳源濃度。

培養(yǎng)基過于豐富，菌體生長過旺，黏度增大，傳質(zhì)差，菌體不得不花費(fèi)較多的能量來維持其生存環(huán)境，即用于非生產(chǎn)的能量大量增加，會(huì)導(dǎo)致物料浪費(fèi)。通過調(diào)整酵母粉、胰胨及蛋白胨等培養(yǎng)基物料的比例，減少添加量過多的氮源物料，可實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化。

產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目對(duì)長型雙歧桿菌和糞腸球菌的培養(yǎng)基物料改進(jìn)配方如表2、表3所示，葡萄糖、乳糖和酵母粉等具體物料的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是藥研所通過小試實(shí)驗(yàn)獲得的。

此外，為進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)培養(yǎng)基化學(xué)組成和菌體需要，結(jié)合動(dòng)力學(xué)原理對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)營養(yǎng)物特性進(jìn)行調(diào)整，在培養(yǎng)基中添加微量元素，分別優(yōu)化了長型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)整了培養(yǎng)基的碳氮比并增加了無機(jī)鹽含量，使能源物質(zhì)的比例達(dá)到最優(yōu)水平，提高了發(fā)酵產(chǎn)率。在華東理工進(jìn)行的中試放樣中，獲得了令人滿意的結(jié)果，為以后發(fā)酵工藝的進(jìn)一步改進(jìn)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

表2 長型雙歧桿菌培養(yǎng)基物料表

表3 糞腸球菌培養(yǎng)基物料表

相比現(xiàn)有工藝，產(chǎn)業(yè)化改進(jìn)后的發(fā)酵培養(yǎng)基更適合長型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的高密度培養(yǎng)。

2 凍干保護(hù)劑改進(jìn)

發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化實(shí)施后，發(fā)酵菌體的得率提高，對(duì)原工藝的凍干保護(hù)劑配比也需要進(jìn)行優(yōu)化。因此，根據(jù)發(fā)酵所獲得的菌體增產(chǎn)情況，在凍干設(shè)備控制參數(shù)不變的情況下，對(duì)凍干保護(hù)劑的配比進(jìn)行調(diào)整，主要包括干濕保護(hù)劑的比例調(diào)整及加量的優(yōu)化，保護(hù)劑試驗(yàn)配方具體如表4所示。

相比現(xiàn)有工藝，產(chǎn)業(yè)化后的培菲康原料凍干菌粉產(chǎn)能可得到有效提升。產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目結(jié)合發(fā)酵工藝改進(jìn)和凍干保護(hù)劑優(yōu)化，可有效提高凍干菌粉的重量和活菌量，實(shí)現(xiàn)保證產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)提高產(chǎn)量的目標(biāo)。

表4 產(chǎn)業(yè)化凍干保護(hù)劑小試處方

3 發(fā)酵參數(shù)控制

培菲康車間進(jìn)行了一系列的產(chǎn)業(yè)化改造項(xiàng)目，改造的具體措施主要有：舊設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng)、新設(shè)備的安裝調(diào)試驗(yàn)證、對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比進(jìn)行優(yōu)化、在發(fā)酵過程中在線實(shí)時(shí)調(diào)控pH值、改進(jìn)發(fā)酵過程的檢測(cè)方法和發(fā)酵終點(diǎn)的判定標(biāo)準(zhǔn)等。隨后，根據(jù)改進(jìn)的發(fā)酵工藝在凍干設(shè)備參數(shù)不變的情況下，對(duì)凍干保護(hù)劑配比進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。通過上述優(yōu)化方法，可在一定程度上提高發(fā)酵的生產(chǎn)效率，能使在發(fā)酵結(jié)束的放罐離心后所獲得的濕菌泥重量、凍干菌粉重量和凍干菌粉活菌量都得到一定的提升。

發(fā)酵控制是取得高產(chǎn)、高質(zhì)產(chǎn)品的必要條件。發(fā)酵控制的先決條件是了解發(fā)酵進(jìn)行的情況，進(jìn)而做出相應(yīng)的調(diào)整，使發(fā)酵過程有利于目的產(chǎn)物的積累和產(chǎn)品質(zhì)量的提高。所謂的發(fā)酵控制參數(shù)即是通過取樣分析獲得的有關(guān)發(fā)酵的信息，其工藝參數(shù)主要可分為物理參數(shù)、化學(xué)參數(shù)和生物參數(shù)。其中，物理參數(shù)包括溫度、壓力、攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌功率、空氣流量和黏度等；化學(xué)參數(shù)主要有pH、基質(zhì)濃度、溶解氧濃度、氧化還原電位、產(chǎn)物濃度、廢氣中氧的含量和廢氣中二氧化碳的含量；生物參數(shù)主要是菌體濃度和菌絲形態(tài)。

培菲康車間現(xiàn)有的工藝控制參數(shù)主要有溫度、壓力、酸度和離線pH。實(shí)施產(chǎn)業(yè)化改造以后，將在現(xiàn)有基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵過程的控制參數(shù)進(jìn)行改進(jìn)，離線檢測(cè)pH的方法為在線實(shí)時(shí)監(jiān)控pH，同時(shí)增加對(duì)發(fā)酵液濁度和還原糖的檢測(cè)，并以此作為發(fā)酵終點(diǎn)判定的標(biāo)準(zhǔn)。

3.1 pH值

微生物發(fā)酵是在一定條件下進(jìn)行的，其代謝變化通過各種參數(shù)反映出來，特別是發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH值的變化，是菌體生長和代謝的綜合表現(xiàn)，對(duì)微生物生長具有非常明顯的影響。在發(fā)酵過程中，要選擇好發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其配比，并控制好發(fā)酵工藝條件，使pH值穩(wěn)定維持在最佳的范圍內(nèi)。若需調(diào)節(jié)發(fā)酵體系的pH，可事先調(diào)節(jié)培養(yǎng)基物料的pH。如需控制消后pH在6.0，消前pH往往要調(diào)到6.5～6.8，可在培養(yǎng)基中加入維持pH的物質(zhì)，如碳酸鈣。此外，也可通過補(bǔ)料方式進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。

目前，培菲康車間仍采用傳統(tǒng)的人工檢測(cè)、手動(dòng)調(diào)節(jié)的方式進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，即在培養(yǎng)基投料時(shí)一次性倒入一定量的碳酸鈣以使發(fā)酵過程的pH緩慢下降。產(chǎn)業(yè)化改造后，新增補(bǔ)料系統(tǒng)包括pH電極、監(jiān)控儀、補(bǔ)料泵和信號(hào)反饋控制系統(tǒng)。該系統(tǒng)可通過插在發(fā)酵罐上的pH電極將發(fā)酵液的pH值通過電信號(hào)傳導(dǎo)至控制器，由控制器對(duì)補(bǔ)料泵進(jìn)行控制補(bǔ)料。通過設(shè)定補(bǔ)料pH值、電極檢測(cè)周期、補(bǔ)料泵轉(zhuǎn)速和響應(yīng)時(shí)間等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)在線實(shí)時(shí)監(jiān)控pH。長型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌在其生長過程中會(huì)產(chǎn)生酸，導(dǎo)致體系的pH下降。通過補(bǔ)料系統(tǒng)可使培菲康的3種菌始終在最適合生長的pH環(huán)境中培養(yǎng)，將有效提高單位時(shí)間的菌體生長速度和最終發(fā)酵菌體的得率。

3.2 濁度測(cè)定

發(fā)酵過程中的菌體形態(tài)和菌體濃度直接反映了菌的生長情況。菌體形態(tài)可通過顯微鏡進(jìn)行觀察，菌體濃度可通過測(cè)黏度法、壓縮體積法（離心）、靜置沉降體積法和比濁法（適合細(xì)菌、酵母）等方法得知。在產(chǎn)業(yè)化改進(jìn)后，增加比濁法對(duì)培菲康生產(chǎn)菌進(jìn)行監(jiān)控。

濁度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)是極其重要的，發(fā)酵液中低濃度的非絲狀菌的OD值與細(xì)胞濃度成線性關(guān)系。OD值一般采用分光光度計(jì)在波長420～660 nm范圍進(jìn)行測(cè)量，要求吸光度值在0.3～0.5范圍內(nèi)。在波長600～700 nm之間，1個(gè)吸光率單位大約相當(dāng)于每升1.5 g細(xì)胞干重。例如，中試發(fā)酵終點(diǎn)取糞腸球菌發(fā)酵液檢測(cè)OD值，數(shù)值為5.0，理論折合400 L發(fā)酵液中細(xì)胞干重約為3 kg。長型雙歧桿菌因發(fā)酵培養(yǎng)基中含有脫脂奶粉，在發(fā)酵液測(cè)定OD值時(shí)會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)干擾，影響檢測(cè)結(jié)果，故產(chǎn)業(yè)化改造項(xiàng)目對(duì)嗜酸乳桿菌和糞腸球菌發(fā)酵過程加入濁度的檢測(cè)，并以該參數(shù)作為這2種菌發(fā)酵終點(diǎn)的判定方法之一。

3.3 還原糖測(cè)定

發(fā)酵過程中糖的消耗反映了生產(chǎn)菌的生長繁殖情況及產(chǎn)物合成的活力。因此，對(duì)發(fā)酵體系殘?zhí)堑臏y(cè)定意義重大。還原糖是指含有自由醛基的單糖，通常指的是葡萄糖。產(chǎn)業(yè)化改造項(xiàng)目增加了對(duì)培菲康3種菌發(fā)酵液的還原糖檢測(cè)，此項(xiàng)改進(jìn)可提供更為客觀精準(zhǔn)的監(jiān)控參數(shù)，以確保對(duì)培菲康生產(chǎn)菌種的發(fā)酵過程進(jìn)行更為精確地監(jiān)控，并提高生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的可控性。

3.4 具體發(fā)酵參數(shù)控制

表5為長型雙歧桿菌預(yù)實(shí)驗(yàn)過程參數(shù)，表6為糞腸球菌預(yù)實(shí)驗(yàn)過程參數(shù)。

表5 長型雙歧桿菌預(yù)實(shí)驗(yàn)過程參數(shù)

進(jìn)入中試階段，表7為長雙歧桿菌中試發(fā)酵過程參數(shù)，表8為糞腸球菌中試發(fā)酵過程參數(shù)，其結(jié)果分別是：長型雙歧桿菌中試結(jié)果（表9）與糞腸球菌中試結(jié)果（表10）。

表7 長型雙歧桿菌中試發(fā)酵過程參數(shù)

表8 糞腸球菌中試發(fā)酵過程參數(shù)

表9 長型雙歧桿菌中試結(jié)果

表10 糞腸球菌中試結(jié)果

依據(jù)中試數(shù)據(jù)，具體發(fā)酵參數(shù)控制為：產(chǎn)業(yè)化長型雙歧桿菌發(fā)酵過程控制（圖1）與產(chǎn)業(yè)化糞腸球菌發(fā)酵過程控制（圖2）。

4 結(jié)語

表11為原料工序產(chǎn)能對(duì)比。

表11 原料工序產(chǎn)能對(duì)比

原車間產(chǎn)能狀況為：長型雙歧桿菌每批平均重量約20.5 kg，糞腸球菌每批平均重量約13.5 kg。若發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化結(jié)合凍干保護(hù)劑優(yōu)化項(xiàng)目實(shí)施后，在生產(chǎn)周期不變、活菌量符合企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)的情況下，長型雙歧桿菌每批平均菌粉的重量預(yù)計(jì)可提高1.3倍，糞腸球菌每批平均菌粉的重量預(yù)計(jì)可增加約1.3倍。若以每天4罐發(fā)酵計(jì)算，則年理論菌粉總產(chǎn)量可達(dá)24 880 kg，與現(xiàn)有工藝相比，年產(chǎn)量增加約6 480 kg。