雙水相萃取分離重組畢赤酵母堿性木聚糖酶

郭金玲，羅發燕，黃 瑞，，龔大春

（1.三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌 443002；2.三峽大學新能源研究院，湖北宜昌 443002）

雙水相萃取分離重組畢赤酵母堿性木聚糖酶

郭金玲1，羅發燕1，黃 瑞1，2，龔大春2

（1.三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌 443002；2.三峽大學新能源研究院，湖北宜昌 443002）

利用雙水相萃取技術對來源于重組畢赤酵母的堿性木聚糖酶進行了初步分離。研究了聚乙二醇（PEG）分子量、PEG濃度、鹽種類及濃度、NaCl加入量和pH等因素對萃取效果的影響。結果表明，在PEG 4000濃度為20%，Na2HPO4濃度為18%，NaCl濃度為0，pH6.0的條件下，獲得最佳萃取效果，其結果為：分配系數（K）8.51，酶的活力回收率（Y）87.2%，純化倍數（PF）2.54。

雙水相萃取，堿性木聚糖酶，分離

木聚糖酶是指能專一降解木聚糖生成低聚木糖和木糖的一組酶的總稱，具有重要的應用價值，自上世紀80年代以來，其應用領域不斷擴大[1]。堿性木聚糖酶是在堿性條件下具有較高酶活的木聚糖酶，可以作為生物漂白劑應用于造紙工業，減少傳統漂白工藝中氯的用量，降低排污負荷，有利于環境保護，同時還可以改善紙張品質[2]。因此，堿性木聚糖酶及其潛在的工業應用前景引起了人們的廣泛關注。

酶制劑的分離純化是其應用的前提，目前，木聚糖酶的純化多采用鹽析和柱層析方法，但是純化成本偏高，因此，開發出一套低成本且適合工業化的純化方法將具有重要的應用價值。雙水相萃取技術始于20世紀60年代，它不僅設備簡單，可連續操作，易于放大，且操作條件溫和，克服了常規萃取中有機溶劑對生物物質的變性作用，在萃取過程中保持生物物質的活性及構型，已成功用于蛋白質、核酸和抗體等高附加值生物產品的分離純化[3-4]。國內外研究者已經嘗試利用雙水相萃取技術分離木聚糖酶[5-7]，而對堿性木聚糖酶的雙水相分離策略還很少有報道。

本研究利用雙水相萃取技術對重組畢赤酵母堿性木聚糖酶進行分離，并對萃取條件進行了摸索，以期為堿性木聚糖酶的工業化生產和應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

畢赤酵母 Pichia pastoris，三峽大學新能源研究院生物質能研究所提供；木聚糖 北京拜爾迪生物技術有限公司；牛血清白蛋白 上海川翔生物科技有限公司，純度≥95%；考馬斯亮藍G-250 廣州翔博生物科技有限公司，純度≥75%；PEG（聚乙二醇，分 子 量 1000 、2000 、4000 、6000）、（NH4）2SO4、MgSO4，K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、HCl、無 水甲醇等 均為市售分析純。

AR2140型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司；SW-CT-1D型凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；ZHWY-1102型恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；電熱恒溫振蕩水槽上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制

1.2.1.1 YPD固體培養基（g/L） 酵母提取物10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0，瓊脂粉20.0。

1.2.1.2 YPD液體培養基（g/L） 酵母提取物10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0。

1.2.1.3 發酵基礎培養基（g/L） 葡萄糖10.0，酵母提取物10.0，MgSO40.03，（NH4）2SO40.5，KH2PO40.5，pH6.0。

1.2.2 粗酶液的制備 菌種活化：按比例配制一定量YPD固體培養基，于121℃下高壓滅菌20min，倒平板，待培養基冷卻，在無菌條件下將保藏于甘油管中重組畢赤酵母接種至平板上，放置28℃恒溫培養箱中培養至長出明顯菌落。

二次活化：按比例配制一定量YPD液體培養基，滅菌后按裝液量25mL/250mL分裝到錐形瓶，無菌條件下，用接種環從已長出明顯菌落的平板上挑取菌種接種到錐形瓶中，置于28℃恒溫搖床振蕩培養24h。

甲醇流加發酵培養：按比例配制發酵基礎培養基，滅菌后按裝液量25mL/250mL分裝到錐形瓶中，以10%（v/v）接種量將二次活化菌液接種至發酵基礎培養基中，再用移液槍按裝液量1.5%（v/v）流加無水甲醇，置于28℃，150r/min的恒溫搖床振蕩培養，每隔24h流加一次甲醇。

粗酶液制備：培養96h后結束發酵，將發酵液放置4℃冰箱靜置沉淀，用之前離心除去酵母細胞和雜質。

1.2.3 雙水相體系制備 取一支20mL離心管，洗凈烘干，按所需比例稱入PEG、無機鹽、NaCl等試劑后，加入一定量蒸餾水并加熱使其溶解，用NaOH或HCl調節系統的pH至所需值后加入1mL粗酶液，用蒸餾水補充至體系總質量為10.0g，振蕩搖勻，3000r/min離心3min使其分層。記錄上下相體積，分別測定上下相蛋白質濃度和堿性木聚糖酶活性。

1.2.4 酶活力的測定 取0.9mL用pH8.0 Tris-HCl配制的1.0%木聚糖溶液于10mL加塞玻璃管中，加入稀釋酶液0.1mL，混勻，50℃水浴10min，取出后立即加入DNS試劑2mL，沸水浴5min，流水冷卻后，用蒸餾水定容至10mL，混勻后于波長540nm比色，以滅活的稀釋酶液為對照，每組做3個平行實驗，結果取平均值，根據光密度值從標準曲線上得出還原糖濃度。在上述條件下，每分鐘釋放1μmol還原糖（以木糖計）所需要的酶量為一個酶活力單位IU。

1.2.5 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍G-250法，以牛血清蛋白作為標準蛋白，通過測定595nm下的吸光度值制作標準曲線并根據樣品吸光度值計算其中的蛋白質含量。

1.2.6 指標的計算

1.2.6.1 相比（R） 為上相和下相的體積比，公式如下：

R=Vt/Vb，其中Vt和Vb分別指的是上下兩相的體積；

1.2.6.2 分配系數（K） 指上相酶活力Xt與下相酶活力Xb之比，公式如下：

1.2.6.3 酶活回收率（Y） 上相萃取總酶活與加入粗酶液酶活之比。

1.2.6.4 純化倍數（PF） 指上相比酶活與粗酶液的比酶活之比。

采用Origin 7.5軟件分析實驗數據，所有實驗重復3次。

2 結果與討論

2.1 PEG分子量的確定

成相聚合物的相對分子質量是影響蛋白質分配平衡的重要因素，它通過改變聚合物與蛋白質疏水區域之間的疏水相互作用影響蛋白質在雙水相系統中的分配行為[9-10]。因此，最佳聚合物分子量的選擇在雙水相萃取實驗中至關重要。為了確定萃取堿性木聚糖酶的最適PEG分子量，分別以不同分子量PEG和（NH4）2SO4構 成 的 雙 水 相 體 系 進 行 實 驗 ，萃 取 條件為：PEG分子量范圍1000~6000，PEG濃度18%，（NH4）2SO4濃 度 12% ，pH5.0，不 加 入 NaCl，結 果 列 于表1。

由表1可知，當PEG分子量為1000時，體系不分層，無法對粗酶液進行萃取分離。當PEG分子量由2000~6000時，酶的分配系數K、酶活回收率Y、蛋白純化倍數PF都呈現先增大后減小的趨勢。這是由于隨著高聚物分子量的增加，高聚物分子與酶分子之間的疏水相互作用增大，因此，分配系數和回收率呈上升趨勢；然而，隨著分子量的繼續增加，分配系數和回收率呈迅速下降趨勢，這可能是由于聚合物空間位阻增大的結果[11]。當PEG分子量為4000時，堿性木聚糖酶在此雙水相體系中的K、Y和PF值均為最大，分別為5.39、84.1%和1.39。因此，在后續的研究中選擇分子量為4000的PEG分離畢赤酵母堿性木聚糖酶。

表1 PEG分子量對堿性木聚糖酶萃取效果的影響Table 1 Effect of PEG molecular weight on the extraction of alkaline xylanase

2.2 PEG濃度的影響

高聚物的濃度同樣是影響雙水相系統萃取效果的關鍵因素。由2.1確定了最佳高聚物為PEG 4000，固 定 其 他 萃 取 條 件 ：即（NH4）2SO4濃 度 12% ，萃 取pH5.0，不 加 入 NaCl，研 究 了 PEG 4000 濃 度（16%~ 24%）對堿性木聚糖酶萃取效果的影響。

由表2可以看出，隨PEG濃度的增大，相比R呈不斷上升的趨勢；當PEG 4000濃度由16%增加至20%時，酶的分配系數K、酶活回收率Y、純化倍數PF都逐漸增加，這是由于隨著高聚物濃度的增大，其與蛋白質分子之間的疏水作用力增加，使得目標酶更容易分配在高聚物相；但是隨著濃度的繼續增大，酶的分配系數K和蛋白純化倍數PF反而逐漸下降，這是由于隨著聚合物濃度的增加，上相自由體積減小，導致分配于上相中的蛋白質減少[12]；然而，由于相比的增大，使得酶的總回收率變化不大。綜合考慮各考察指標，確定PEG 4000濃度為20%，此時分配系數、回收率和蛋白純化倍數分別為6.07、85.2%和1.64。

表2 PEG 4000濃度對堿性木聚糖酶萃取效果的影響Table 2 Effect of PEG 4000 concentration on the extraction of alkaline xylanase

2.3 最佳無機鹽種類的確定

不同種類鹽的正負離子在雙水相體系中的分配系數不同，從而改變雙水相系統的相間電位，同時，鹽的種類和濃度還會改變蛋白質的表面疏水性，最終影響蛋白質在兩相間的分配平衡[9]。因此，成相鹽的選擇也是雙水相萃取操作中的重要環節。根據2.1和2.2的研究結果，固定PEG 4000濃度20%，萃取pH 5.0，不加入NaCl，研究（NH4）2SO4、K2HPO4、Na2HPO4和KH2PO4等成相無機鹽對堿性木聚糖酶萃取效果的影響，結果如表3所示。

在實驗的三個濃度下，KH2PO4與PEG 4000均無法形成兩相體系。由表3數據可知，在由（NH4）2SO4、Na2HPO4、KH2PO4與PEG 4000構成的雙水相體系中，Na2HPO4/PEG 4000體系萃取效果最好，分配系數K、酶活回收率Y和純化倍數PF都明顯高于其他兩種鹽，因此，選擇Na2HPO4作為成相鹽進行下一步研究。

2.4 Na2HPO4濃度的影響

為了研究成相鹽濃度對堿性木聚糖酶在雙水相體系中分配特性的影響，在上述研究的基礎上，固定其他萃取條件為：PEG 4000濃度20%，pH5.0，不加入NaCl，考察了成相鹽Na2HPO4濃度在16%~24%變化時，雙水相體系對堿性木聚糖酶的萃取效果（表4）。

如表4所示，相比R隨Na2HPO4濃度的增大逐漸降低；當鹽濃度低于18%時，隨著其濃度的增大，分配系數K和回收率Y都成上升趨勢，這是由于成相鹽的鹽析作用，使得更多的堿性木聚糖酶分配在雙水相體系的上相；然而，當Na2HPO4濃度大于20%時，酶的分配系數和回收率迅速降低，這主要歸于過高濃度鹽導致的蛋白質相界面沉淀；當Na2HPO4濃度為18%時，萃取效果最好，分配系數K、回收率Y和純化倍數PF分別為8.25、87.5%和2.49。因此，確定雙水相系統成相鹽Na2HPO4的最佳濃度為18%。

表3 無機鹽種類對木聚糖酶萃取的影響Table 3 Effect of salts on the extraction of alkaline xylanase

表4 Na2HPO4濃度對堿性木聚糖酶萃取效果的影響Table 4 Effect of Na2HPO4concentration on the extraction of alkaline xylanase

表5 NaCl濃度對堿性木聚糖酶萃取效果的影響Table 5 Effect of NaCl concentration on the extraction of alkaline xylanas

2.5 NaCl加入量的影響

不同電解質正負離子的分配系數不同，當雙水相系統中含有這些電解質時，因為兩相均應各自保持電中性，從而產生不同的相間電位，此外，中性鹽的 加 入 可 以 加 速 相 分 離 、改 變 蛋 白 質 的 疏 水 性[10]。NaCl是其中最常用的中性鹽，目前已有大量通過加入NaCl改善雙水相系統萃取效果的報道[13-14]。因此，本研究考察了NaCl加入量對萃取效果的影響，萃取 條 件 為 ：PEG 4000 濃 度 20% ，Na2HPO4濃 度 18% ，pH5.0，NaCl濃度0%~12%，結果列于表5中。

NaCl的加入對其指標的影響不明顯（p＞0.05，結果未列出）；如表5所示，添加NaCl對萃取效果無強化作用，隨著加入NaCl濃度的增加，萃取各項指標呈下降趨勢。因此，確定萃取過程中不加入NaCl等中性鹽。張蘭威等[15]利用PEG1000/MgSO4雙水相體系分離風干香腸中蛋白酶的研究中也得到同樣的結果。

2.6 pH對萃取效果的影響

雙水相體系的pH也是影響生物分子分配行為的重要因素。為了研究pH對畢赤酵母堿性木聚糖酶分離效果的影響，在上述優化的條件下，即：PEG 4000濃度20%，Na2HPO4濃度18%，不加入NaCl，將雙水相體系的pH調至5.0~8.0范圍內，研究pH對萃取效果的影響，結果列于表6中。

pH變化對相比的影響可以忽略不計（p＞0.05，結果未列出）；當pH為6.0時萃取效果最佳，分配系數K、酶活回收率Y和純化倍數PF均達到最大，分別為8.51、87.2%和2.54倍；當pH高于6.0時，萃取效果明顯下降。通常，pH通過改變目標蛋白質和雜質的帶電性、離子組成和表面特性，影響其在上下相間的分配特性。此外，pH還可以改變雙水相體系的離子組成[16]。許多利用雙水相萃取技術分離酶分子的研究均發現pH對萃取效果有較大影響，且萃取有最適pH。本研究中，適合畢赤酵母堿性木聚糖酶萃取的最適pH為6.0。

表6 體系pH對木聚糖酶萃取的影響Table 6 Effect of pH on the extraction of alkaline xylanas

3 結論

通過考察雙水相體系萃取畢赤酵母堿性木聚糖酶的條件，確定最佳成相聚合物是PEG 4000，濃度為20%，最佳成相鹽是Na2HPO4，最適濃度為18%，最適pH為pH6.0，萃取過程中不需要加入中性鹽NaCl，在此條件下，最佳萃取結果為：分配系數K為8.51，酶的活力回收率Y為87.2%，純化倍數PF為2.54。

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Separation of alkaline xylanase from Pichia pastoris using aqueous two-phase extraction

Aqueous two-phase system was used to separate alkaline xylanase from recombinant Pichia pastoris. The effects of molecular weight of the PEG，PEG concentration，phase forming salts，salt concentration，neutral salt（NaCl） concentration and pH on enzyme partitioning and purification were investigated.The results showed that PEG 4000 concentration 20% ，disodium hydrogen phosphate concentration 18% ，without NaCl，under the condition of pH6.0 were the optimal conditions.And the best results were achieved as follows：partition coefficient（K） 8.51，enzyme activity recovery（Y） 87.2%and the purification factor（PF） 2.54.

aqueous two-phase extraction；alkaline xylanase；separation

Q814.1

A

1002-0306（2014）22-0172-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.029

2014－01－06

郭金玲（1980-），女，博士，講師，研究方向：生物催化與生物分離。

三峽大學人才科研啟動金（KJ2010B033）。