金黃色葡萄球菌生物被膜檢測及控制方法研究進展

王 瓊，唐俊妮，陳 娟，史 輝

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都 610041）

金黃色葡萄球菌生物被膜檢測及控制方法研究進展

王 瓊，唐俊妮*，陳 娟，史 輝

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都 610041）

金黃色葡萄球菌極易在食品的加工、儲存過程中形成生物被膜，使得被膜內的細菌很難被清除，給食品安全帶來了巨大隱患。綜述了金黃色葡萄球菌生物被膜的形成、檢測、控制方法和影響因素，特別是針對國內外金黃色葡萄球菌生物被膜的檢測及物理、化學和生物等控制方法進行了詳述，旨在為食品工業領域生物被膜的消除提供借鑒。

金黃色葡萄球菌，生物被膜，形成，檢測，控制方法

細菌生物被膜是由微生物細胞以及它們分泌的保護性和吸附性的基質共同形成的三維結構的聚合物[1]。生物被膜的形成為細菌構建了一個保護性的生長環境，使細菌能夠限制治療的抗生素，以及食品工廠的消毒劑、殺菌劑等化學品的進入，并且屏蔽了寄主的免疫防御功能，使生物被膜里面的細菌不斷增殖和擴散，造成持續性的慢性感染和食品反復污染[2]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見的食源性病原細菌，很容易形成生物被膜，其產生的生物被膜能引起食品加工過程中能量的損耗、產品貨架期的縮短，給企業帶來巨大的經濟損失，更嚴重的是影響到食品的安全性，導致食源性疾病，給消費者的健康帶來危害，甚至威脅到生命安全。同時，已形成的生物被膜還有可能是其他致病菌及腐敗微生物的藏身之所，生物被膜內部細菌間的群體感應使得多種細菌能夠協同共生，從而增加了食品加工環境以及食品本身污染或再污染的風險，甚至引起食物中毒事件。有研究表明食品加工過程中常用設備中的不銹鋼、鋁等材料表面具有大量微細溝槽、縫隙等，極易殘留微生物，從而可能形成生物被膜，采用機械沖洗甚至擦洗、以及消毒劑處理等方法均很難徹底清除生物被膜[3]。鑒于生物被膜形成的復雜性，為了能更好的控制生物被膜造成的危害，本文根據近年來的文獻報道對金黃色葡萄球菌生物被膜的形成、檢測、控制方法及影響因素等方面進行綜述，旨在為食品工業領域生物被膜的消除提供借鑒。

1 生物被膜的形成

生物被膜的形成是細菌為適應自然環境而采取的一種生存策略，當細菌受到各種壓力，如極端的營養缺乏或過剩，低pH，高滲透壓，氧化，抗菌劑和抗生素等，細菌在接觸物表面與浮游細菌相對應的一種生長方式，是由附著于惰性或活性實體的細菌細胞分泌的多糖基質、纖維蛋白、脂質蛋白等多聚物構成胞外基質，將其自身包裹其中而形成的大量細菌聚集物[4]。這是細菌所具有的一種非常重要的環境適應機制。金黃色葡萄球菌生物被膜的形成通常涉及幾個明顯的階段，包括起始的黏附，細胞與細胞之間的吸附與增殖，生物被膜的成熟以及細菌的分離與擴散等過程[5]，綜合起來如圖1所示。在形成生物被膜的過程當中，細菌細胞首先和支撐物表面產生瞬時的表面碰觸，然后定位在其表面，最后細胞大量積累。這一過程中細菌細胞先形成單層的膜，再由單層被膜中的細菌增殖而形成三維結構完整的成熟的生物被膜[6]。金黃色葡萄球菌生物被膜生物膜的結構非常復雜，它是一系列復雜大分子的聚合體。包括多糖物質，如β-1，6-聚-N-乙酰葡萄糖胺（PNAG）或胞間黏附多糖（PIA）[7]；胞外DNA[8]（eDNA），指菌體自溶釋放的胞外DNA，是生物膜基質的重要組成成分；胞外蛋白 質 和 細 胞 壁 磷 壁 酸[9]；脂 質[10]和 其 他 環 境 中 的 物質。已有研究表明金黃色葡萄球菌生物被膜基質的組成是可以根據細胞外環境變化而改變的[11]。

圖1 生物被膜形成主要過程示意圖Fig.1 The diagram of biofilm formation

2 生物被膜的檢測

建立快速、靈敏、準確、簡便的檢測方法，能夠有效控制由生物被膜引起的食品加工環境以及食品本身的污染或再污染，防止食源性疾病的發生。目前檢測細菌生物被膜的方法有三磷酸腺苷（ATP）生物發光法，高效液相色譜法，熒光素二乙酸酯法，平板擦拭法，掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM），激光共聚焦掃描顯微鏡法（CLSM），銀染法，結晶紫染色法，剛果紅實驗，報告基因檢測技術，以及近年來發展的PCR鑒定，肽核酸（PNA）探針熒光原位雜交技術等[12]。其中最常用的是染色法和顯微鏡檢法，如Christensen[13]在研究金黃色葡萄球菌在器械表面形成生物被膜時，首次應用了結晶紫染色法，此后經過不斷改進，該方法目前已經成為一種廉價，直接和常用的檢測細菌 生 物 被 膜 形 成 方 法 ；銀 染 法[14]是 被 廣 泛 采 用 的另一種定性檢測生物被膜形成能力的方法，用來證明多糖蛋白復合物和細菌生物被膜的共存，樣本需經AgNO3等溶液浸泡處理，這種檢測方法可靠、特異、高效、省時簡便，臨床上可用于大量細菌生物被膜形成能力的鑒定。顯微鏡檢法利用SEM，TEM和CLSM可以直接檢測細菌生物被膜表層的形態學，對于細胞間的連結、纖維樣多糖和細胞間質清楚可辨，其中CLSM是近年才發展起來的用于組織形態學研究的一項新技術，也廣泛應用于實驗室生物被膜的檢測，它可對透光樣本進行分層掃描拍攝，常用于細菌生物被膜立體結構的形態學研究[15]。另外，分子檢測技術也不斷在發展，Arciola等[16]通過剛果紅平板法驗證icaA和icaD基因只在能夠形成被膜的菌株中存在，由此采用了一種簡單、快捷、可靠的PCR鑒定方法來檢測金黃色葡萄球菌生物被膜形成與icaA和icaD基因的關系，結果顯示這種方法應用于檢測金黃色葡萄球菌被膜形成是可靠的，且比傳統的剛果紅實驗更高效。肽核酸探針熒光原位雜交技術是Malic等[17]發現的一種檢測慢性傷口生物被膜菌感染的一個可靠的工具，這種技術具有良好的雜交特異性和雜交動力特性，與CLSM配合使用，探針熒光原位雜交技術還能檢測和鑒定慢性傷口感染生物膜中的細菌種類立體結構及分布情況[18]。

事實上，在實際操作過程中通常是將這幾種檢測 技術 結 合 起 來 使 用 ，如 邢 明 勛 等[18]在 研 究 阿 奇 霉素對金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力的實驗中，通過剛果紅平板法初步驗證受試菌株產生生物被膜的能力，再通過結晶紫染色、銀染和熒光染色結合CLSM技術，進一步觀察金黃色葡萄球菌形成生物被膜的形態，證明了生物被膜在結構上存在多樣性、開放性、不均一性等特點。唐俊妮[19]、黃瑩瑩等[20]研究則采用微孔板法來檢測金黃色生物被膜形成能力，并結合SEM及CLSM對已形成的生物被膜進行形態學研究。

3 生物被膜的控制

在食品加工過程中，許多食源性病原菌易在富有養分和有機物質的固體表面黏附并形成生物被膜。這些黏附的微生物比浮游生長的細菌對消毒劑具有更強的抵抗能力。對各種化學藥品（包括各種消毒劑）、加熱、光照和干燥都存在耐受性，在清洗過程中，病原菌的散播會產生空氣懸浮粒，然后附著在加工設備材料表面，尤其易在一些不易清洗的地方形成生物被膜，如裂紋、拐角處、墊圈、管道材料連接處等。生物被膜中的細菌被厚厚的胞外多糖蛋白復合物包繞，不易獲得養分和氧氣，代謝率比較低，被膜深層的細菌處于休眠狀態，不進行頻繁的細胞分裂，往往體積較小，對殺菌劑不敏感[3]。因此，在越來越強調食品安全的大環境下，迫使人們不得不加強研究力度去尋找控制生物被膜的方法。

3.1 物理方法

去除生物被膜常見的物理方法有超高磁場、超聲波處理、高脈沖電場、低電場等[3]。楊葆華等[21]用優化的超聲波平板法，利用超聲波的“空化”效應，設定超聲波功率135W，處理時間14min，處理溫度35℃，將生物被膜從接觸表面充分剝離，實驗效果優于平板擦拭法。低強度的電流（Electrical Current，EC）能夠增強抗菌劑對生物被膜的抗菌活性，del Pozo等[22]證明了應用EC可以增強萬古霉素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的殺滅作用，但EC增強抗菌劑對生物被膜的清除作用因菌種和抗菌劑的不同，效果會有所改變。常壓等離子體失活技術[23]，是利用高壓放電在低氣壓狀態下發生輝光放電產生活性氧和自由基來滅活微生物，該技術對細菌形成的生物被膜和浮游菌都具有殺菌作用。Niemira等[24]認為電離輻射能夠有效地的殺滅生物被膜菌和浮游菌，是一種有效的物理去除生物被膜的方法，常用于處理與食品接觸的衛生設備表面生物被膜相關的細菌。

3.2 化學方法

二氧化氯是一種速效、廣譜、低毒的新型消毒劑，陳 秋 云 等[25]研 究 了 不 銹 鋼 表 面 金 黃 色 葡 萄 球 菌生物被膜對二氧化氯的敏感性，結果顯示金黃色葡萄球菌生物被膜形式比以浮游形式對二氧化氯具有更強的抵抗能力且營養物質能明顯減弱二氧化氯的殺菌效果。生物被膜的形成和有機營養物質大大提高了其耐藥性，對殺菌劑的殺菌效果影響很大，因此，食品加工企業在日常消毒時，一定要有效去除附于加工設備表面（尤其是死角處）的有機營養物質，選用適當的清潔劑和消毒劑，防止生物被膜形成，這樣才能達到有效的消毒效果。Chaw等[26]研究表明低濃度的銀離子（50μg/L）對生物膜中的細菌沒有滅活能力，但離子狀態的銀離子可以結合在生物分子的供電子基團表面，可以減穩生物被膜基質與胞外多聚物的分子間作用力，因此，可采用協同作用方式利用銀離子對生物被膜分子間作用力進行減穩。Schlag等[27]證實5mmol/L的亞硝酸鹽能夠抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。郭志華等[28]研究證明了0.2mmol/L的EDTA可有效抑制金黃色葡萄球菌生物被膜形成；EDTA只能影響金黃色葡萄球菌生物被膜形成的早期階段；Ba2+不能完全阻斷EDTA抑制生物被膜生成，Fe2+、Ca2+、Mg2+可以阻斷EDTA抑制生物被膜的效應；即使是高濃度的EDTA也不能影響成熟的細胞被膜數量；EDTA能抑制細胞之間的黏附作用。

3.3 天然提取物

近年來，植物原料作為新的殺菌劑也得到廣泛應用。牛至精油和其主要酚類化合物——香芹酚和百里香酚具有廣泛的抗菌譜。Nostro等[29]研究表明，牛至精油和2種酚類化合物對生物被膜態的金黃色葡萄球菌的殺滅濃度分別0.25%～1.0%（v/v）和0.125%～0.500%（v/v），亞致死濃度的精油可以削弱金黃色葡萄球菌的生物被膜形成。Nostro等[30]進一步證實香芹酚能夠顯著降低聚苯乙烯表面的生物量和細菌黏附數，并進一步證明在其亞抑制劑量（1/2，1/4和1/8 MIC）時，酸性pH條件下香芹酚對表皮葡萄球菌生物被膜較中性pH條件下具有更高的清除作用，對生物被膜的形成也具有潛在的抑制作用。在用5%茶樹油處理1h之后，不僅金黃色葡萄球菌的生物被膜被完全去除，而且其中的金黃色葡萄球菌也被殺滅[31]。王曉紅等[32]研究證明了從新西蘭桃柁羅漢松中提取出天然活性物質桃柁酚，可以有效減少胞外DNA（eDNA）的釋放并抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，并且抑制趨勢呈劑量依賴關系，而當桃柁酚添加量為1/8× MIC藥物濃度時，可以誘導生物被膜形成。此外，桃柁酚也可以通過影響Agr和Sar調控系統，作用于cidA基因進而影響eDNA釋放及生物被膜的形成。

3.4 抗生素類

阿奇霉素作為一種廣譜抗生素，具有免疫調節、抗微生物、抗生物被膜等作用，并且還具有良好的耐受性，成為了最常用的抗生素之一。邢明勛等[18]研究表明，阿奇霉素對金黃色葡萄球菌懸浮菌和生物被膜具有較好的抗菌活性及抗毒素作用，同時對金黃色葡萄球菌生物被膜的形成及兔紅細胞的溶血活性具有顯著的抑制作用，這將有助于治療由金黃色葡萄球菌導致的感染。氨溴索（AMB）能破壞金黃色葡萄球菌已經形成的生物被膜，與萬古霉素（VAN）聯合應用后，可使生物被膜內金黃色葡萄球菌顯著減少，顯示出了協同殺菌作用[33]。低于最低抑菌濃度的黃芩苷在體外對金黃色葡萄球菌的生物被膜具有破壞作用，與左氧氟沙星聯合應用，可顯著增強左氧氟沙星對生物被膜的殺菌作用[12]。黃芩素能破壞耐甲氧西林金黃色葡萄球菌已形成的早期生物被膜，增強萬古霉素對生物被膜內耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的清除作用，且黃芩素破壞生物被膜及其協同殺菌作用強于克拉霉素（CLR）[34]。克拉霉素可以協同抗生素增強其對生物被膜內金黃色葡萄球菌的殺菌作用。單用氧氟沙星抗菌效果并不顯著，克拉霉素可明顯增強其抗菌能力，二者具有協同作用，十四元環大環內酯類藥物克拉霉素能夠抑制生物膜，并提高氧氟沙星透過菌膜的能力，提示克拉霉素可作為控制金黃色葡萄球菌生物膜形成及相關感染的藥物，應用于臨床治療此類疾病[35]。

五倍子的濃度在大于或等于0.25mg/mL時，對浮游的金黃色葡萄球菌有殺菌、抑菌的作用，但對金黃色葡萄球菌生物被膜作用不明顯；當五倍子與1/4最低抑菌濃度（MIC=0.128mg/mL）的阿奇霉素聯合作用后可顯著減少細菌的黏附性，減少培養液和被膜中存活菌數，證明五倍子與阿奇霉素聯合用藥可增強對金黃色葡萄球菌生物被膜的殺菌作用[36]。然而采用抗生素也只局限于實驗條件下，在實際環境中，生物被膜外面還附著有大量的細胞碎片、血小板、以及機體的各種代謝物，抗生素的作用并不能達到理想的效果，對于食品加工環境以及其他環境，這種方法并不可取。

3.5 酶類

溶葡萄球菌酶是一種最初從模仿葡萄球菌中分離獲得的含Zn2+內切肽酶，對細菌胞壁肽聚糖交聯結構中的五甘氨酸橋聯具有特異水解作用[37]。白寧等[38]通過研究重組溶葡萄球菌酶對金黃色葡萄球菌的體外清除作用，發現不同濃度的重組溶葡萄球菌酶能夠有效地減少金黃色葡萄球菌生物被膜中的活菌數。唐俊妮等[19]研究表明，耐熱核酸酶和DNaseⅠ對金黃色葡萄球菌生物被膜的形成起到抑制作用。Mann等[39]發現證實了葡萄球菌核酸酶可以降解胞外DNA，促進了細胞的分散，抑制了生物被膜的形成。

3.6 食品添加劑

謝麗斯等[40]在添加低質量濃度防腐劑山梨酸鉀和苯甲酸鈉后，金黃色葡萄球菌成膜能力降低，當兩者質量濃度均≥0.4g/L時，能夠完全抑制被膜的形成，且山梨酸鉀抑制成膜趨勢比苯甲酸鈉明顯；添加質量濃度為3g/L的單甘酯時成膜率最低，而雙甘酯質量濃度為4g/L成膜率最低，兩者比較，在質量濃度2~4g/L范圍內單甘酯抑制成膜比雙甘酯好；對于蔗糖酯類乳化劑，在質量濃度0.3~4g/L范圍，能顯現抑制成膜作用；非離子型表面活性劑吐溫-80、Span-60對金黃色葡萄球菌成膜影響不同，與兩者自身親水親油性相關。因此，這幾類食品添加劑對金黃色葡萄球菌生物被膜具有一定抑制作用。Shanks等[41]研究顯示，濃度高于0.5%的檸檬酸鈉，可以有效地抑制金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物被膜的形成及細胞生長，然而，對于大多數受試的金黃色葡萄球菌，亞抑菌濃度的檸檬酸鈉能夠顯著地刺激其生物被膜的形成。Sauer等[42]用7%（w/v）檸檬酸鈉緩沖液（0.24mmol/L，pH=6.2），0.05% 亞 甲 基 藍 ，0.15% 對 羥基苯甲酸甲酯和0.015%對羥基苯甲酸丙酯制成聯合殺菌劑：檸檬酸/亞甲基藍/對羥基苯甲酸酯（citrate/ methylene blue/parabens，C/MB/P）能夠顯著減少金黃色葡萄球菌生物被膜形成量及生物被膜的厚度，對預成型以及成熟的生物被膜中的金黃色葡萄球菌有迅速殺滅作用，能夠完全清除從生物被膜中分離的浮游態細菌。

4 其他外界影響因素

金黃色葡萄球菌具有溫和的疏水性和顯著的路易斯堿的性質，其在聚苯乙烯上形成被膜的最初黏附與生長基質中離子強度呈正相關。大多數菌株在37℃時較25℃時形成的生物被膜多；增加葡萄糖的量能提高被膜生成量；孵化時，NaCl和MgCl2的存在能夠顯著降低生物被膜形成量[43]。我們實驗室通過對金黃色葡萄球菌生物被膜形成變化與外在培養條件影響關系進行研究，也證實了培養基中的糖類可以促進生物被膜的形成，NaCl對生物被膜的形成起抑制作用，并且不同的培養基在實驗室條件下對被膜形成的影響具有很大差異[44]。通過改善食品接觸表面的表面性質以阻止微生物在其表面上的黏附也可以作為一種控制生物被膜的途徑。不同的食品接觸表面形成生物被膜的能力有所不同，與玻璃和PE塑料相比，不銹鋼表面黏附形成生物被膜的活菌數較多[45]。Jaglic等[46]證明在不利于微生物生長的溫度（6~ 22℃）和靜態條件下，會導致表皮葡萄球菌的黏附和形成生物被膜。相反，在有利于微生物生長的溫度下，微生物的大量繁殖則使得黏附的細胞很容易從不銹鋼表面上脫附下來。

5 結論與展望

生物被膜是一種復雜的微生境，生物被膜的形成受到菌種、菌量、接觸表面類型、營養條件和生長環境等諸多因素的影響。各種不同的細菌生物被膜的形成沒有一致的途徑，即使是同一種細菌也沒有明確的具體途徑，它們可以隨著環境的變化而產生相應的變化。鑒于食品加工過程中常用設備中的不銹鋼、鋁等材料表面具有大量微細溝槽、縫隙等，極易殘留微生物，從而形成細菌生物被膜。食品生產企業應建立完整HACCP體系，確定食品生產過程中可能形成生物被膜的關鍵點，并對各個關鍵點采取適宜，高效和安全的方法進行控制。通過抑制生物被膜的形成和殺滅生物被膜中的金黃色葡萄球菌，從而降低食品中由金黃色葡萄球菌生物被膜引發的食源性疾病暴發。

隨著生物信息學的發展，在研究生物被膜形成過程中越來越多的引入了生物信息學的方法，以后通過提高細菌生物被膜檢測水平，建立快速靈敏準確簡便的檢測方法，利用芯片技術、雙向電泳、有效的報告基因和基因敲除等分子技術，結合核磁共振和激光共聚焦顯微技術，從基因組水平和蛋白組水平來構建生物被膜形成的分子模型，充分了解金黃色葡萄球菌生物被膜的形成機理[6]，為建立有效的生物被膜去除和預防策略奠定理論基礎。

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Research progress in detection and control methods of Staphylococcus aureus Biofilm formation

WANG Qiong，TANG Jun-ni*，CHEN Juan，SHI Hui
（College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China）

Staphylococcus aureus is easy to form biofilm in food processing and storage，which makes the bacteria in the biofilm more difficult to be eradicated and brings great dangers to food safety.The biofilm formation，detection，control methods and influence factors of S.aureus were reviewed in this text，especially for the detection and physical，chemical and biological control methods.It would provide an important guidance on S.aureus biofilm elimination for food industry.

Staphylococcus aureus；biofilm；formation；detection；control methods

TS201.6

A

1002-0306（2014）22-0371-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.073

2014－03－11

王瓊（1990-），女，碩士研究生，研究方向：畜產品加工與安全。

* 通訊作者：唐俊妮（1971-），女，副研究員，研究方向：食品安全。

國家自然科學基金資助項目（31071515，31371781）；教育部新世紀人才支持計劃（NCET-11-0847）。