鼠李糖乳桿菌發酵大豆酸乳工藝優化研究

楊雪嬌，張予心，宋秋梅，姚 曼，張 敏，樸春紅，劉俊梅，于寒松，王玉華

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118）

鼠李糖乳桿菌發酵大豆酸乳工藝優化研究

楊雪嬌，張予心，宋秋梅，姚 曼，張 敏，樸春紅，劉俊梅，于寒松，王玉華*

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118）

以大豆為主要原料，將鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）進行活化、馴化與保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）按一定比例混合制備發酵劑，通過單因素實驗和正交實驗優化確定酸豆乳發酵的生產工藝。結果通過單因素實驗確定上述三個菌種按1∶0.5∶1混合作為工作發酵劑；正交實驗研究結果表明影響豆乳發酵的顯著因素依次為料水比、接種量、發酵時間和蔗糖添加量，最佳條件是：接種量為5%，磨制豆漿料水比為1∶8，蔗糖添加量為8%，在43℃條件下發酵5h，該條件下生產的酸豆乳，具有濃郁的風味和細膩酸甜的口感。

大豆，酸豆乳，鼠李糖乳桿菌，發酵

目前，國際公認與人體共生的益生乳酸菌主要有 ：保 加 利 亞 乳 桿 菌（L.bulgaricus）、嗜 熱 鏈 球 菌（S.themophilus）、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosum）、雙歧桿菌（B.bacterium）等。鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus），從屬于乳桿菌，有抗氧化性，調節微生態平衡，增強宿主腸道抵抗力，預防和治療腹瀉，通過發酵豆乳還可以激發大豆中大豆異黃酮完全水解葡萄糖苷酶，在糖尿病動物模型中，比未經鼠李糖乳桿菌發酵的豆乳顯著的降低了血糖水平，總膽固醇濃度，甘油三酯和提高抗氧化酶活性[1]；尤其本研究選用的鼠李糖乳桿菌B10通過氧化途徑能夠減低酒精對小鼠肝臟氧化損傷，達到修復酒精性肝損傷的作用[2]；動物和人體實驗表明鼠李糖乳桿菌有一定的抑菌效果和加強免疫系統的功效，可用于各種食品，保健食品和微生態制品或藥品的研制[3]。

大豆富含蛋白質，必需氨基酸，且維生素、礦物質的含量均較高，飽和脂肪酸含量則較低[4]，其中大豆異黃酮的雌激素作用影響到激素分泌、代謝生物學活性、蛋白質合成、生長因子活性，是天然的癌癥化學預防劑[5]；大豆磷脂對動脈硬化癥、肝臟病、老年癡呆具有一定預防作用[6]。大豆營養豐富但由于大豆中存在的脂肪氧化酶會使豆乳產生豆腥味使得豆乳發展收到一定限制，研究表明，乳酸菌可以分解脂肪酶，從而使產品在具有較好的口感和清爽的風味下更易于人體的吸收[7-9]。

目前我國市面上利用鼠李糖乳桿菌發酵制得的豆乳產品這一領域仍是空白，本研究以東北優質大豆為主要原料，對鼠李糖乳桿菌在豆乳中進行馴化培養研究，用馴化的鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）、保 加 利 亞 乳 桿 菌（L.bulgaricus）和 嗜 熱 鏈 球 菌（S.themophilus）混合作為發酵劑進行酸豆乳生產研究，通過研究料水比、蔗糖添加量、菌種比例、接種量、發酵溫度及時間對豆乳發酵的影響，以酸乳的感官為指標確定鼠李糖乳桿菌大豆酸乳發酵最佳工藝條件，研制出具有濃郁風味的大豆酸奶。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠李糖乳桿菌B10[2]（L.rhamnosus）、保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（S.themophilus）凍干菌粉 微生物實驗室保藏；大豆、白糖、脫脂奶粉 市售；碳酸氫鈉 食用級。

APV2000實驗型高壓均質機 上海順儀科技有限公司；BS-FD立式恒溫培養搖床 蘇州威爾實驗用品有限公司；FE-05磨漿機 上海田崗機械制造有限公司；BCD-271TMBA海爾冰箱 海爾集團有限公司；GMSX-280B手提壓力蒸汽消毒器 沈陽科瑞永興化玻儀器有限公司；PHS-3C酸度計 上海康儀儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 大豆處理 挑選表面光澤無霉爛變質的大豆，用水浸泡12h，使大豆達到飽和狀態，再用堿水浸泡[10]（0.25%NaHCO3溶液浸泡2h），鈍化脂肪酶，去除豆腥味，將浸泡好的大豆及浸泡液倒入磨漿機磨漿，收取豆漿，再用120目的篩網過篩、1500r/min離心5min，加入白砂糖混合后100℃，10min煮沸，鈍化脂肪 酶 ，去 除 豆 澀 味[11]，在 85℃ ，壓 力 為 20MPa下 均 質5min，95℃下殺菌5min，降溫至發酵溫度，備用。

1.2.3 菌種活化 將鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）、保 加 利 亞 乳 桿 菌（L.bulgaricus）和 嗜 熱 鏈 球 菌（S.themophilus）凍干菌粉按1%（體積比）分別接種于MRS液體培養基中，42℃培養，傳代3次，使培養時間在12~18h內活菌數達1×109CFU/mL以上。

將1%鼠李糖乳桿菌培養菌液分別接種于含2%葡萄糖的滅菌脫脂乳（脫脂奶粉與蒸餾水質量體積比為1∶10）培養基中，42℃培養，傳代2次，4℃冷藏備用。

將保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（S.themophilus）凍干菌粉按1%（體積比）分別接種于脫脂乳培養基中，42℃培養，傳代3次，4℃冷藏備用。

1.2.4 菌種馴化 將活化后的鼠李糖乳桿菌B10接種于豆乳中進行馴化，脫脂乳與豆乳比例由1∶0、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1依次進行傳代培養，馴化[12]。

1.2.5 工作發酵劑制備 各菌種按3%接種量接種上述馴化后菌種于100～300mL三角瓶豆乳中，42℃培養，鼠李糖乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在豆乳中凝乳后即為母發酵劑。

1.3 單因素實驗

1.3.1 菌種比例對發酵產酸及感官的影響 將鼠李 糖 乳 桿 菌（L.rhamnosus）、保 加 利 亞 乳 桿 菌（L.bulgaricus）和 嗜 熱 鏈 球 菌（S.themophilus）按0.5∶0.5∶1、0.5∶1∶1、1∶0.5∶1、1∶1∶1比例為母發酵劑以3%的量接種豆乳基質中，42℃，保溫發酵3～4h，冷卻，置于4℃的冰箱過夜，進行滴定酸度產酸量測定和感官評定[13]。

1.3.2 料水比對豆乳發酵的影響 大豆酸奶凝乳狀態的成因是蛋白質的凝固，豆乳的濃度一定程度上決定了酸豆乳的質構。合適的豆乳濃度可以使大豆酸奶在飲用時口感細膩滑爽，料水比會對最終產品狀 態 及 固 形 物 含 量 產 生 一 定 影 響[14-15]，將 泡 好 的 黃豆，分別按1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g/mL）的料水比磨漿，依次磨漿，將處理好的豆乳在20MPa下均質5min，95℃殺菌，冷卻至發酵溫度，無菌條件下接種量為4%，在40℃下恒溫發酵6h。

1.3.3 接種量對發酵產酸的影響 接種量的選擇是保持大豆酸奶具有良好口感的重要環節，豆乳中若加入菌種多，則產酸高；反之，則產酸低。但接種量并非越大越好[16]。將菌種按一定比例分別將2%、3%、4%、5%、6%的接種量接人1∶8料水比制成的豆乳中，42℃發酵4h后測定酸度，研究不同接種量對菌種發酵的影響。

1.3.4 蔗糖添加量對豆乳口感的影響 豆乳發酵中加入一定量蔗糖可以改善產品的甜酸度，使產品更符合大多數人的要求，且口感更細膩潤滑。將蔗糖按2%、4%、6%、8%、10%的比例添加到料水比為1∶8磨制而成的豆乳中，接種量為5%，研究不同蔗糖添加量對豆乳質感和口感的影響。

1.3.5 發酵溫度及時間對豆乳發酵的影響 按料水比1∶8制備豆乳，加入8%的蔗糖，85℃殺菌30min，冷卻后按1∶0.5∶1的接種比例接種5%，分別于37、40、43、46℃下培養，每隔1h測定一次酸度。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal level of form factors

1.4 發酵條件正交實驗

根據單因素實驗的結果，對影響豆乳發酵的四個主要因素：料水比、接種量、蔗糖添加量、發酵時間進行正交優化，采用L9（43）正交實驗設計，確定表1正交實驗因素水平表，通過酸度和感官評分優選出最佳組合。

表2 酸豆乳感官評定標準Table 2 Sensory evaluation standard of fermented soymil

1.5 感官評價

1.5.1 色澤與組織狀態評定 用潔凈的燒杯取適量混合均勻的樣品置于明亮處觀察酸豆乳的色澤及其組織狀態進行評定。

1.5.2 風味與滋味的品評 取到樣品后立即嗅其風味，用溫水漱口后再對其滋味進行品評。

由5名男生5名女生共10名學生組成感官鑒評小組，并接受感官鑒評培訓。小組成員要求對發酵豆乳的表觀、氣味、風味和質地指標進行評價[17]。具體品評標準見表2，感官評分為100分制。

2 結果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌在豆乳中馴化結果

為了提高鼠李糖乳桿菌在豆乳中的生長能力和發酵性能，本研究將鼠李糖乳桿菌接種牛乳與豆乳的梯度混合物進行馴化，觀察其凝乳時間、酸度和活菌數。結果見表3。

表3 鼠李糖乳桿菌馴化結果Table 3 Results of L.rhamnosus domestication

鼠李糖乳桿菌在豆乳中馴化后，凝乳時間為5h，凝乳活菌數1.1×109cfu/mL，凝乳時酸度65.3°T，馴化后的鼠李糖乳桿菌可以發酵豆乳。

2.2 菌種比例對發酵產酸及感官的影響

酸豆乳產品的酸度與感官性狀與不同菌種比例的添加量有著直接關系。其中，鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus），保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（S.themophilus）三者的比例不同對酸豆乳的酸度，粘稠度，口感等均有一定影響。結果見表4。

表4 菌種比例對酸奶酸度和感官的影響Table 4 Effect of Strain ratio on acidity and sensory

由 表4可 知 ，當 鼠 李 糖 乳 桿 菌（L.rhamnosus），保 加 利 亞 乳 桿 菌（L.bulgaricus）和 嗜 熱 鏈 球 菌（S.themophilus）三者的比例為1∶0.5∶1時，酸乳的酸度和感官性狀均較為理想，所以作為最適比例。

2.3 料水比對豆乳發酵的影響

合適的豆乳濃度可以使大豆酸奶在飲用時口感細膩滑爽，分別按1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g/mL）的料水比磨漿，以凝乳狀態和口感考察料水比對豆乳發酵的影響。

表5 料水比對豆乳發酵的影響Table 5 Effect of material to water ratio in soybean yogurt

從表5中可以看出，料水比1∶6（g/mL）的豆乳，發酵效果雖好，酸度較好，但固形物含量高，而且乳質地較硬口感較差。料水比大于1∶8（g/mL）的豆乳，凝乳狀態不好，且有乳清析出，所以本實驗選擇最佳料水比為1∶8（g/mL）。

2.4 接種量對發酵產酸的影響

接種量低，產酸較少，接種量太高，產酸過快，凝乳過快，造成酸豆乳風味和組織上的缺陷[15]。圖1為接種量對發酵產酸的影響結果。

圖1 接種量對發酵產酸的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on fermentation acid production

從圖1可以看出接種量從2%上升到5%時，酸度逐漸增加。接種量從5%上升到6%時，酸度基本不變。因此選擇5%的接種量為最佳的接種量。

2.5 蔗糖添加量對豆乳口感的影響

表6 蔗糖添加量對豆乳口感的影響Table 6 Effect of sucrose content on product quality

由表6可以看出添加小于6%的蔗糖，酸豆乳的口感較差，添加6%的蔗糖酸度較小，10%蔗糖，甜度偏高；添加8%的蔗糖可以使酸豆乳的乳質細膩潤滑，酸度適中，優化后酸甜適口，因此8%的蔗糖最佳。

2.6 發酵時間及溫度對豆乳發酵的影響

圖2 發酵溫度及時間對發酵產酸的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature and time on fermentation acid production

乳酸菌發酵豆乳的溫度通常在37~43℃之間，不同的菌種發酵溫度也不一樣。

由圖2可以看出在43℃以下發酵的酸豆乳在酸度隨發酵時間的延長和溫度的升高而增大，溫度在46℃下發酵時，3h之內就基本終止發酵，且酸度在55°T左右，所以從生產成本口感風味上選擇43℃下發酵5h為最佳。

2.7 正交實驗結果

為了進一步優化以鼠李糖乳桿菌為主要發酵劑的酸豆乳發酵工藝條件，對料水比、接種量、發酵時間和蔗糖添加量進行了正交實驗，結果見表7。

從表7的極值和Fα值可以看出，影響豆乳發酵的依次為：A料水比、B接種量、D發酵時間、C蔗糖添加量 ，其 中A因 素 Fα＞F0.05=5.14，說 明 料 水 比 對 發 酵 豆乳影響顯著。酸度值輔助感官評價，酸度過高或過低都不會得到最佳感官，綜合各因素得到最佳優化組合為A2B2C3D2，即接種量為5%，料水比為1∶8磨制豆漿，添加8%的蔗糖，在43℃條件下發酵5h。

從正交實驗結果表中可以看出對生產產品進行感官評價，9組實驗中10人感官評價平均得分為76.81分，口感評分最好的是第四組，即接種量為5%，料水比為1∶10磨制豆漿，添加8%的蔗糖，在43℃條件下發酵6h，但是料水比過大影響了豆乳的凝乳狀態，且發酵5h就可以達到的口感和酸度，發酵再長時間不利于經濟利益，所以通過正交實驗得出的最優組合即接種量為5%，料水比為1∶8，蔗糖添加量為8%，發酵溫度43℃發酵5h的條件下制取的酸豆乳，既具有濃郁的風味和細膩酸甜的口感。

3 討論

目前，世界發達國家和地區對乳酸菌的研究已 從 以 雙 歧 桿 菌（B.bacterium）和 嗜 酸 乳 桿 菌（L.acidophilus）為代表的第一代益生乳酸菌發展到以 鼠 李 糖 乳 桿 菌（L.rhamnosum）和 干 酪 乳 桿 菌（L.bacilluscasei）等在內的第二代新型益生乳酸菌，但我國對于第二代乳酸菌的應用卻還很少。第二代乳酸菌的優點是，抗氧化性更強，可順利通過胃酸環境在人體腸道定植[18]。Yuhua Wang等學者[19-21]的研究表明鼠李糖乳桿菌可以促進腸道粘膜屏障功能基因如ITF、MUCI-3及其他與缺氧反應相關的基因表達，降低了酒精引起的消化道通透性，進一步研究表明鼠李糖乳桿菌可以顯著降低酒精引起的腸道內肉毒素的增加，從而顯著降低了酒精性肝損傷的嚴重性。Miettinen等在實驗中發現，鼠李糖乳桿菌能夠抑制食物中革蘭陰性致病菌引起的免疫功能失調，并能誘導產生較多的TNF-α、IL-6和IL-10[22]。

在豆乳發酵的研究中，楊東升[23]、賈艷萍等[24]學者采用大豆乳與牛乳按比例混合，接種保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌的混合菌種進行發酵，與本研究完全采用豆乳并接種鼠李糖乳桿菌相比，由于人體中只含有L-乳酸脫氫酶，因此只能代謝L-乳酸，鼠李糖乳桿菌在發酵過程中只產生L-乳酸，不會產生對產品安全性和口感有影響的其他酸類[25]，因此本研究的酸豆乳更易于人體吸收利用且大豆中不含膽固醇；在菌種方面，賈建波[26]將燕麥粉碎滅酶后加入脫脂乳，接種鼠李糖乳桿菌（江南大學生物工程學院提供）發酵，本研究采用的鼠李糖乳桿菌B10具有更好地抗氧化性[2]。在此之前，國內的科技文獻中還沒有對鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）作為發酵劑生產酸豆乳的相關研究。

4 結論

本研究通過單因素和正交實驗分別從菌種比例、豆漿料水比以及接種量等方面討論了鼠李糖乳桿菌大豆酸乳發酵工藝的優化，最終通過酸度測定和感官評價確定了混合發酵劑的最佳比例及發酵參數，制得了具有濃郁風味的酸豆乳，其中對于鼠李糖乳桿菌在豆乳發酵領域的探討，具有一定的研究價值和實際應用前景。

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Study on the optimization of fermentation conditions of Lactobacillus rhamnosus soybean yoghurt

YANG Xue-jiao，ZHANG Yu-xin，SONG Qiu-mei，YAO Man，ZHANG Min，PIAO Chun-hong，LIU Jun-mei，YU Han-song，WANG Yu-hua*
（Food Science and Engineering College，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Using soy as the main material， the Lactobacillus bulgaricus （ L.bulgaricus ） and Streptococcus thermophilus （S.thermophilus ） with the activated and domesticated Lactobacillus rhamnosus （L.rhamnosus）was prepared by a centain percentage as mixed fermentation agent，through the single factor test and orthogonal experiment to determine the fermented soymilk production process.Results of testing to determine the three strains by single factor as work by 1 ∶0.5∶1 mixed.The order of affecting the fermentation of soymilk that the orthogonal test results showed were water ratio，inoculation，fermentation time and the amount of sugar added，the best conditions were：inoculum size of 5% ，the material to water ratio in soybean yogurt of 1 ∶8，the addition of sugar 8%，43℃ under the conditions of fermentation 5h.The conditions of production of soybean yogurt，with a rich flavor and delicate sweet and sour taste.

soybeans；soybean yoghurt；L.rhamnosus；fermentation

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0184-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.032

2014－01－14

楊雪嬌（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物與功能性食品。

* 通訊作者：王玉華（1972-）女，教授，研究方向：食品微生物與功能性食品。

長春市科技計劃項目（2011111）；現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-04）；國家自然科學基金項目（31101252）。