解脂耶氏酵母lip2脂肪酶水解谷維素產生阿魏酸的研究

張 宸，嚴 勃，孟永宏，郭玉蓉，鄧 紅，魏麗娜

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安 710062）

解脂耶氏酵母lip2脂肪酶水解谷維素產生阿魏酸的研究

張 宸，嚴 勃，孟永宏*，郭玉蓉，鄧 紅，魏麗娜

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安 710062）

對解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）脂肪酶水解谷維素產生阿魏酸的酶反應體系進行了研究。實驗發現解脂耶氏酵母全脂肪酶粉（105U/mg）在50mmol/L pH7.0 Tris-HCl（含7.5mmol/L黃膽酸鈉），100mmol/L pH6.0磷酸鈉緩沖液（含1000U脂肪酶）的體系中，水解產生阿魏酸的得率為2.94%。為了進一步提高脂肪酶水解效率，對解脂耶氏酵母脂肪酶中主要組分lip2脂肪酶基因進行了克隆，整合至畢赤酵母GS115基因組后發酵制取lip2脂肪酶粉（70.1U/mg），于上述酶解體系中進行水解谷維素實驗。實驗結果表明阿魏酸產率為2.87%。獲得的lip2脂肪酶催化效率略低于全脂肪酶粉催化效率，但是獲得了單一的脂肪酶基因，為進一步采取分子進化技術提高其催化能力奠定了基礎。

阿魏酸，脂肪酶，解脂耶氏酵母，酶解工藝

阿 魏 酸（Ferulic acid）是 植 物 界 常 見 的 一 種 酚酸，廣泛存在于當歸、樟白皮等中藥材中[1]。它具有鎮靜、抗癌、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集、降血脂等獨特功能，且不會在人體內過多累積[2-3]，因此，在食品、醫藥工業上得到廣泛的應用。現階段工業化生產阿魏酸的方法主要是利用高濃度堿水解谷維素得到阿魏酸。這種方法生產成本高，易造成環境污染[4]。考慮到酶法水解反應條件溫和，對環境污染小，且隨著固定化酶等技術的出現，可大大降低反應成本[5]，是未來工業化綠色制備阿魏酸的研究重點。

谷維素是由阿魏酸和環木菠蘿醇等植物甾醇構成的結合酯，因此，可利用酯酶或脂肪酶水解酯鍵酶解谷維素制備阿魏酸[6-7]。國外已有采用酯酶來水解谷維素的先例[8]，也包括一些利用阿魏酸酯酶和多糖降解酶的協同作用[9]。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一種能分泌 多 種 代 謝 產 物 的 非 常 規 酵 母[10]，它 能 利 用 甘 油 酯為誘導物，產生多種脂肪酶，具有很多優良特性，是重要的工業用脂肪酶。解脂耶氏酵母共有8個脂肪酶基因，其中lip2脂肪酶更是一種性能優良的脂肪酶，具備很高的酯化、水解和轉酯化活性，目前已被廣泛應用到酯水解和合成，生物柴油制備等領域[11-12]。

本文選取解脂耶氏酵母為研究材料，發酵獲得全脂肪酶粉，對酶水解谷維素產生阿魏酸的酶解體系進行初步篩選。同時采用畢赤酵母表達系統，獲得高效表達lip2脂肪酶的基因工程菌G115/lip2，并對lip2脂肪酶粉水解谷維素的能力進行了研究，為酶法工業化制備阿魏酸的綠色工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

畢 赤 酵 母GS115、E.coli DH5α 菌 株 購 于 中 國微 生 物 菌 種 保 藏 中 心 ；Y.lipolytica菌 株 、pPic9K質粒 本實驗室保存；谷維素（純度99.3%） 西安海斯夫生物科技有限公司；阿魏酸標品（純度99.9%）

Sigma公司；其他所有化學試劑 天津市科密歐化學試劑有限公司和Sigma上海分公司；限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶及相關試劑 購自TaKaRa、Promega、Sigma 公 司 及 國 內 各 生 產 廠 商 ；DNA膠回收試劑盒、DNA Marker 均購自上海生工生物有限公司。

梯度PCR儀 Applied Biosystems公司；AG 22331型電穿孔儀 Eppendorf公司；LC-10AT型高效液相色譜儀 島津儀器蘇州有限公司；Z-16PK型低溫離心機 Sigma公司。

1.2 引物

用于擴增解脂耶氏酵母基因組上lip2脂肪酶基因的上下游引物分別為：P1（5’-AAGAATTCATGAA GCTTTCCACCATCCT-3’），P2（5’-TTGCGGCCGCTT ATTAAAGTAGATAGTT-3’），其中劃線部分分別為引入的EcoRⅠ與NotⅠ酶切位點；用于鑒定外源基因整合至畢赤酵母GS115基因組his4位點的上下游引物（依據巴斯德畢赤酵母表達手冊）為：P3（5’-GACT GGTTCCAATTGACAAGC-3’），P4（5’-GGCAAATGG CATTCTGACATC-3’）。引物合成和DNA序列分析分別在南京金斯瑞生物有限公司和上海生工生物有限公司完成。

1.3 培養基

LB、YPD、BMGY、BMMY、MD、MM等培養基參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達手冊。酶活檢測平板為含有0.2%三丁酸甘油酯的BMMY培養基平板；液體搖瓶發酵培養基：魚蛋白胨6%，豆油4%，尿素0.1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，其中尿素過濾除菌（0.22μm）。

1.4 實驗方法

1.4.1 脂肪酶粉的制備 挑取酵母菌單菌落接種于5mL YPD培養基中，于30℃振蕩培養12～14h，然后以1%接種量接種至脂肪酶發酵培養基中，30℃，220r/min發酵72h；將發酵液于3000r/min離心10min，取上清酶液并加入3%的PEG2000，電磁攪拌2h溶解，濾紙過濾后取濾紙上的固體物質，加入3倍體積的冷酒精洗脫3次，冷丙酮洗2次，最后制得的固體自然風干，即得到酶粉[13]。

1.4.2 酶粉酶活測定方法 脂肪酶活性測定采用堿滴定法[14]。操作步驟如下：酶活力測定以橄欖油乳化液（橄欖油∶PVA=1∶3，v/v）為底物。取37℃溫浴后的5mL橄欖 油 乳 化 液 和4mL 100mmol/L pH8.0的 PBS，加入適當溶解稀釋的1mL脂肪酶粉，于37℃、130r/min反應10min，加入15mL無水乙醇以終止反應。酶催化水解產生的脂肪酸通過50mmol/L的NaOH滴定測定，加兩滴0.5%酚酞指示滴定終點。在37℃，pH8.0的條件下，脂肪酶每分鐘水解橄欖油產生1μmol/L游離脂肪酸所需的酶量定義為一個活力單位（U）。

1.4.3 阿魏酸含量的測定 采用高效液相色譜法對阿 魏 酸 含 量 進行 檢測[15]，檢 測 波 長 為315nm，色 譜 柱為Welch Ultimate XB-C18色譜柱（4.6×250mm，5μm，Welch Materials公司），流動相組份及配比為甲醇∶水∶冰乙酸=35∶65∶0.9，流速為1.0mL/min。

1.4.4 脂肪酶粉水解谷維素酶解體系實驗 取20mg的谷維素樣品于500μL丙酮溶解后加入25mL具塞三角瓶中，并在不同的水解體系[8，16-17]中（水解體系見結果中表1）加入1000U脂肪酶粉，于37℃，140r/min反應48h。以HPLC法測定阿魏酸含量并計算得率。

1.4.5 載體的構建與轉化 以解脂耶氏酵母基因組DNA為模板，利用P1和P2為引物擴增lip2基因，PCR產物膠回收純化并與pGEM T-easy載體相連，連接產物轉化感受態細胞E.coli DH5α后篩選陽性克隆子，插入的基因通過測序確認。對測序正確的克隆子過夜培養抽提質粒，使用EcoRⅠ和NotⅠ對質粒進行雙酶切得到具有粘性末端的目的條帶，經T4連接酶16℃過夜連接至用相同內切酶雙酶切后的表達載體pPic9K中，構建得到pPic9K/lip2重組質粒，對重組質粒進行測序驗證。驗證正確的重組質粒pPic9K/lip2按照畢赤酵母表達手冊，用his4位點上的SalⅠ內切酶得到10μg線性化質粒DNA與80μL GS115感受態細胞混合，1.5kV電擊轉化后將細胞涂布到不含組氨酸MD平板上，28℃培養2～3d，成功轉化的his+轉化子可在無組氨酸的MD平板上生長。

1.4.6 畢赤酵母轉化子表型鑒定、篩選及驗證 將轉化后所得到的陽性轉化子于MD和MM平板上進行Mut+/Muts表型鑒定；并采用G418濃度梯度YPD平板篩 選 畢 赤 酵 母 多 拷 貝 轉 化 子[19]；以 篩 選 得 到 轉 化 子的基因組為模板，P3和P4引物進行PCR擴增驗證基因表達盒的正確插入；陽性轉化子點接在含有0.2%三丁酸甘油酯的BMMY平板上，觀察其脂肪酶表達能力[18]。陽性重組子命名為GS115/lip2。

1.4.7 lip2脂肪酶粉水解谷維素實驗 對重組子經發酵制取的lip2脂肪酶粉，測定其脂肪酶活性，并運用全脂肪酶粉最優酶解體系進行谷維素水解實驗，HPLC法測定阿魏酸含量，并計算阿魏酸得率。

1.5 數據處理

阿魏酸得率的按照下式進行計算：

表1 解脂耶氏酵母全脂肪酶粉水解谷維素制取阿魏酸的得率Table 1 The ferulic acid yield of oryzanol hydrolysis by Yarrowia lipolytica lipase powder

2 結果與分析

2.1 脂肪酶水解谷維素酶解體系優化實驗

通過1.4.1方法制取解脂耶氏酵母全脂肪酶粉，并經堿滴定法測得解脂耶氏酵母全脂肪酶粉酶活為105U/mg。

由表1可知，未加入解脂耶氏酵母全脂肪酶粉的體系2和體系3中，阿魏酸產量很少或者幾乎沒有，其中，含牛黃膽酸鈉的體系2水解效率略優于不含牛黃膽酸鈉的體系3，說明牛黃膽酸鈉作為乳化劑，可增大反應液中油水兩相的接觸面積，使更多的谷維素與水相遇發生水解反應，進而提高了阿魏酸的得率。體系1、4、5、6中均加入了1000U的全脂肪酶粉，阿魏酸得率均有很大的提高。說明解脂耶氏酵母脂肪酶粉對谷維素確實具有水解作用，但其阿魏酸得率不高。對比體系1與體系4可以得出，使用牛黃膽酸鈉作為乳化劑其作用效果優于使用PVA-1750作為乳化劑；而使用50mmol/L pH7.0 Tris-HCl作為酶解反應的緩沖液，阿 魏 酸 產 量 要 大 于 使 用100mmol/L pH7.0 PBS的 反應緩沖液，其原因可能是由于Tris-HCl中的離子更能保護及穩定脂肪酶的構象及活力，使其在反應體系中保持穩定的底物轉化能力。由阿魏酸得率可知，谷維素在50mmol/L pH7.0 Tris-HCl（含7.5mmol/L牛黃膽酸鈉），100mmol/L pH6.0磷酸鈉緩沖液（含1000U脂肪酶）的酶解體系中得率最高，產率可達到2.94%。

圖1 lip2 PCR擴增產物（A）及pPic9K-lip2雙酶切驗證（B）Fig.1 PCR amplification of Y.lipolytica lip2 gene（A） and double digestion of the plasmid by EcoRⅠ and NotⅠ（B）

2.2 lip2脂 肪 酶 基 因 的 克 隆 與pPic9K-lip2表達載體的構建

以解脂耶氏酵母DNA為模板，P1和P2作為引物擴增得到的lip2脂肪酶基因，大小約為1005bp，見圖1（A）。測序結果與NCBI上lip2脂肪酶基因序列比對結果序列一致。生物信息學分析結果顯示，lip2脂肪酶蛋白含334個氨基酸，其蛋白分子式為C1659H2549N437O488S13，相對分子質量為36840.9，等電點為5.57，總原子數為5146；脂溶指數為93.38，疏水性平均值為-0.005，說明lip2脂肪酶是一個脂溶性、疏水性蛋白。

PCR產物回收后進行TA克隆，對測序正確的陽性克隆子抽提質粒，與載體pPic9K分別經EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切處理后T4過夜連接，構建分泌型表達載體pPic9K-lip2（圖2）。pPic9K-lip2雙酶切電泳見圖1（B），測序分析結果驗證載體構建正確。

圖2 畢赤酵母分泌表達載體pPic9K-lip2框架圖Fig.2 Schematic diagram of the Pichia recombinant expression plasmids pPic9K-lip2

2.3 畢赤酵母重組子的轉化和鑒定

經內切酶SalⅠ線性化后的表達載體pPic9K-lip2電轉化至P.pastoris GS115中，得到的轉化子經MD和MM平 板 鑒 定 為His+/Mut+ 型 。 于 高G418 濃 度（＞1.5mg/mL）的抗性平板上篩選得到畢赤酵母多拷貝轉化子，共計16株。異硫氫酸胍法快速提取畢赤酵母轉化子的基因組DNA為模板，P3和P4為引物，PCR驗證基因表達盒是否成功插入畢赤酵母基因組his4位點，結果如圖3所示。從PCR結果來看，篩選到的畢赤酵母GS115/lip2重組子都能擴增出兩條片段，分別是AOXI基因片段（2.2kb）和約1.5kb片段（片段大小=目的基因長度+492bp），表明所挑選的轉化子都是陽性克隆，且屬于Mut+型。

圖3 畢赤酵母GS115/lip2陽性重組子的PCR驗證Fig.3 PCR of positive recombinant

將陽性轉化子點接在含有0.2%三丁酸甘油酯的BMMY平板上，培養24~48h后，發現這些陽性重組子均能產生水解透明圈（圖4）說明畢赤酵母GS115/lip2重組子可以有效表達脂肪酶。

圖4 畢赤酵母GS115/lip2重組子分解三丁酸甘油脂產生透明圈Fig.4 Transparent circle formation of recombinant on tributyrin agar plate

2.4 lip2脂肪酶粉水解谷維素制取阿魏酸實驗

對16株畢赤酵母GS115/lip2重組子進行搖瓶發酵，分別對發酵液測定其脂肪酶活力。選取催化活力最高的一株重組子重新進行發酵，通過1.4.1方法制取lip2脂肪酶粉，經堿滴定法測得lip2脂肪酶粉酶活達到了70.1U/mg。

以2.1中的最優水解體系（體系1和體系5）按1.4.4方法進行lip2脂肪酶酶粉水解谷維素制備阿魏酸實驗，HPLC法測定阿魏酸產量，體系1和體系5阿魏酸得率分別為2.07%和2.87%。由結果可知，畢赤酵母GS115/lip2重組子lip2脂肪酶粉對谷維素具有一定水解作用，且阿魏酸得率略低于解脂耶氏酵母全脂肪酶粉水解谷維素的阿魏酸得率（約2.94%）。其原因可能在于：一是全脂肪酶粉中可能含有對谷維素水解效率較高的其他同工脂肪酶；二是各個脂肪酶作用于谷維素時可能會產生協同作用，提高了脂肪酶的單一作用效果。

本研究雖然發現了解脂耶氏酵母脂肪酶對谷維素有一定的水解作用，但是阿魏酸得率較低。可能的原因有：解脂耶氏酵母脂肪酶谷維素水解特異性較差，水解效率不高；酶水解反應體系還需要繼續優化和篩選；所制得的脂肪酶粉酶活相對較低，酶粉質量不高，其在酶水解谷維素體系中的擴散性不好，可能也會影響到對谷維素的水解效率。

另外，在解脂耶氏酵母基因組中有lip1~lip8脂肪酶同工酶基因。本文只研究了lip2脂肪酶水解谷維素制備阿魏酸的能力，其他的同工酶基因可以參照本文中的方法繼續研究，有一定的借鑒意義。

3 結論

對解脂耶氏酵母發酵所制得的全脂肪酶粉，進行了谷維素酶水解制備阿魏酸實驗，結果發現解脂耶氏酵母全脂肪酶粉對谷維素有一定的水解效率，水解反應條件為：50mmol/L pH7.0 Tris-HCL（包含7.5mmol/L牛 黃 膽 酸 鈉），100mmol/L pH6.0 磷 酸 鈉 緩沖液（包含1000U脂肪酶粉），阿魏酸得率為2.94%。同時運用分子生物學手段，成功獲得了高效表達lip2脂肪酶基因的GS115/lip2基因工程菌，研究發現其制得的lip2脂肪酶對谷維素也具有水解作用，阿魏酸得率為2.87%。通過本研究，證明了解脂耶氏酵母lip2脂肪酶對谷維素有一定的水解效率。因此，可在本研究的基礎上，可利用分子進化技術，對lip2脂肪酶基因進行分子改造，繼續進行高效能脂肪酶的篩選研究，以期獲得高谷維素特異性的酵母菌脂肪酶，為酶法工業化水解谷維素制備阿魏酸的綠色工藝奠定基礎。

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Production of ferulic acid from oryzanol by Y.lipolytica lip2 enzyme-catalyzed

ZHANG Chen，YAN Bo，MENG Yong-hong*，GUO Yu-rong，DENG Hong，WEI Li-na
（Shaanxi Normal University，College of Food Engineering and Nutritional Science，Xi’an 710062，China）

An appropriate enzymatic system was preliminary explored for the Yarrowia lipolytica lipase.The study found that the optimal enzyme reaction system for the whole lipase powder was 50mmol/L pH7.0 Tris-HCl（containing 7.5mmol/L ammonium taurocholate），100mmol/L pH6.0 PBS（containing 1000U lipase powder），and the ferulic acid yield was 2.94%.To further improve the efficiency of hydrolysis of lipase，lip2 lipase gene was cloned and integrated in Pichia pastoris GS115 genome，and the lip2 lipase powder was obtained by fermentation.Using the optimal enzyme reaction system to hydrolysis oryzanol，the results showed that the ferulic acid yield by lip2 lipase powder was 2.87%.This efficiency was slightly lower than the whole lipase powder hydrolysis efficiency.However，a single lipase gene was obtained，which would lay the foundation of improving the catalyze ability to hydrolysis oryzanol by molecular evolution technology.

ferulic acid；lipase；Yarrowia lipolytica；hydrolysis process

TS222.1

A

1002-0306（2014）22-0189-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.033

2014－02－24

張宸（1988-），女，碩士研究生，主要從事食品生物工程方面的研究。

* 通訊作者：孟永宏（1975-），男，博士，副教授，主要從事食品生物工程方面的研究。

陜西省科技統籌（2011KTCQ02-04）；教育部博士點專項科研基金（20130202120007）；2012年度中央高校科研基本業務費重點項目。