油橄欖鮮果中總黃酮提取工藝優化及其含量隨不同成熟度的變化

鄧俊琳，王寒冬，劉 露，丁春邦，*，李 天，楊澤身

（1.四川農業大學生命科學與理學院，四川雅安 625014；2.四川農業大學農學院，四川成都 611130；3.涼山州中澤新技術開發有限責任公司，四川西昌 615000）

油橄欖鮮果中總黃酮提取工藝優化及其含量隨不同成熟度的變化

鄧俊琳1，王寒冬1，劉 露1，丁春邦1，*，李 天2，楊澤身3

（1.四川農業大學生命科學與理學院，四川雅安 625014；2.四川農業大學農學院，四川成都 611130；3.涼山州中澤新技術開發有限責任公司，四川西昌 615000）

以油橄欖鮮果為材料，采用響應面法對超聲波輔助提取油橄欖總黃酮工藝進行優化，并測定皮瓜爾、弗奧、克羅萊卡、卡林、鄂植、云臺、配多靈、科拉蒂八個品種的六個成熟度的總黃酮含量。基于單因素實驗，以料液比、甲醇濃度、超聲溫度和超聲時間為自變量，油橄欖總黃酮提取量為響應值，確定最佳提取工藝條件：料液比1∶23（g/mL）、甲醇濃度80%、超聲溫度48℃、超聲時間30min，油橄欖鮮果總黃酮提取量為0.8567mg/g。八個油橄欖品種的總黃酮含量隨成熟度增加，呈現先下降后略有上升的變化趨勢，含量最高為克羅萊卡的第一成熟度3.9042mg/g，最低為云臺的第四成熟度0.7189mg/g，鄂植和配多靈從第三成熟度開始總黃酮含量顯著高于其他品種。

油橄欖，總黃酮，響應曲面法，超聲波輔助，成熟度

油 橄欖（Olea europaea L.）又 名 洋 橄 欖 、齊 墩 果 ，屬 木 犀 科 木 犀 欖 屬 植 物 ，為 世 界 四 大 木 本 油 料 作 物之一。主要分布于地中海沿岸地區，后經引種廣泛栽植于我國甘肅南部、四川西南部、云南西北部金沙江流域等地[1]。油橄欖是一種高經濟效益的樹種，橄欖果既可生產食用油又可加工成餐用油，榨油后的果渣可作飼料、肥料或燃料，嫩枝梢和葉可做茶[2]。油橄欖的主產品——橄欖油含有大量的不飽和脂肪酸和多種酚酸類、黃酮類、維生素及色素類生物活性成分[3]，具有促進骨骼和神經系統發育、預防心腦血管疾病、抗衰老等多種功能，因而有“食用植物油皇后”的美譽[4]。研究表明，橄欖油中的黃酮類化物質具有抗氧化、抗菌、抗病毒、防癌抗癌等多種生物活性功能，其含量與橄欖油品質有著密切的聯系[5-7]。

目前，國內外提取植物黃酮類化合物的方法較多，如溶劑提取法、微波提取法、超聲波提取法、酶解法、超臨界流體萃取法、雙水相萃取分離法、半仿生提取法等[8]。油橄欖果中黃酮類化合物的提取多采用 溶劑 浸提 法[9-10]，但 該 法 存 在 溶 劑 消 耗 多 、提 取 時間長、提取效率低、成本高等缺陷[5]。超聲波提取法利用超聲波在液體中強烈的空化作用加速植物有效成分的浸出，具有操作簡便、提取效率高等優點，已被廣泛用于植物次生代謝產物的提取[11]。因此本實驗采 用 響 應 面 法（response surface methodology，RSM）對油橄欖果中總黃酮的超聲波輔助提取工藝進行優化，并測定八個品種六個成熟度的總黃酮含量，以期為油橄欖果中黃酮類化合物的深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油橄欖鮮果 2013年6～10月采自四川西昌的北河油橄欖基地，共選取八個品種六個成熟度，成熟度以 果 皮 、果 肉 色 澤 區 分[12]，冷 凍 儲 存 備 用 ；蘆 丁 成都市科龍化工試劑廠；甲醇、三氯化鋁 均為分析純。

BT-124S電子天平 德國Sartorius公司；RM-220實驗室超純水機 四川沃特爾科技發展有限公司；KQ-300GDV恒溫數控超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司；高速冷凍離心機 德國Thermo公司；UV-1750分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 油橄欖果中總黃酮提取量的測定 總黃酮提取 量 的 測 定 采 用 AlCl3顯 色 法[13]，稍 加 改 動 ：取 待 測液400μL，加2mL甲醇，搖勻，再加1.6mL AlCl3試劑搖勻，靜置10min，于415nm檢測吸光值。以蘆丁質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.0038X-0.0035：（R2=0.9992，線性范圍50~250μg/mL）。

總黃酮提取量（mg/g）=樣品液中總黃酮質量濃度×樣品液體積×稀釋倍數/初始油橄欖粉末質量/ 1000。

1.2.2 油橄欖果中總黃酮的提取 將冷凍的油橄欖果實去核，加液氮研成粉末，準確稱取0.5g粉末，加甲醇超聲波浸提，離心，收集上清液，定容，按1.2.1方法測定并計算總黃酮提取量。

1.2.3 單因素實驗 以第二成熟度的皮瓜爾為研究材料，油橄欖果總黃酮提取量為指標，研究料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，固定甲醇濃度100%，超聲溫度40℃，時間30min）、甲醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%，固定料液比1∶20，超聲溫度40℃，時間30min）、超聲溫度（30、40、50、60、70℃，固定料液比1 ∶10，甲 醇 濃 度 100% ，超 聲 時 間30min）、超 聲 時 間（10、20、30、40、50min，固 定 料 液 比 1 ∶10，甲 醇 濃 度 100%，超聲溫度50℃）對總黃酮提取量的影響。

1.2.4 響應面優化實驗設計 在單因素實驗結果的基礎上，根據Box-Behnken設計原理，以料液比（A）、甲醇濃度（B）、超聲溫度（C）和超聲時間（D）為自變量，以油橄欖果中總黃酮提取量為響應值，設計四因素三水平表，實驗設計如表1所示。

表1 響應面分析因素及水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 不同成熟度果實的總黃酮含量測定 測定八個品種六個成熟度的總黃酮含量，初步探討油橄欖果實中總黃酮含量在不同成熟階段的變化。

1.3 數據處理

所有數據均為3次重復實驗的平均值，應運Microsoft Excel 2010、SPSS 20.0、Design expert 8.0 對數據進行處理、分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 料液比對油橄欖總黃酮提取量的影響 總黃酮提取量隨溶劑量的增加而增加，當料液比1∶20時提取量達到0.74775mg/g，之后溶劑量繼續增大，提取量增加緩慢，這可能是由于細胞中有效成分已基本溶出，即使溶劑量增大，對提取量無明顯影響（圖1）。為節省提取溶劑的角度考慮，將優化料液比選定為1∶10、1∶20、1∶30。

圖1 料液比對總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids

2.1.2 甲醇濃度對油橄欖果總黃酮提取量的影響總黃酮提取量隨甲醇濃度的增大逐漸增加，當甲醇濃度為60%時，提取量達最大0.8606mg/g，濃度繼續增加，提取量反而下降，這可能是由于甲醇濃度過高，脂溶性物質大量溶出，導致黃酮類化合物提取量下降（圖2）。因此選擇甲醇濃度40%、60%、80%作響應面分析。

圖2 甲醇濃度對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of methanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

2.1.3 超聲溫度對油橄欖果總黃酮提取量的影響隨著提取溫度的升高，總黃酮提取量逐漸增加，當提取溫度到達40℃時，提取量達最大值0.6444mg/g，溫度升高增加溶劑分子和溶質分子的運動，促進擴散，利于總黃酮的溶出[14]；但溫度繼續升高時，總黃酮提取量反而下降，可能由于溫度過高，造成總黃酮化合物的降解，導致提取量下降（圖3）。所以優化提取溫度選擇30、40、50℃。

圖3 超聲溫度對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids

2.1.4 超聲時間對總黃酮提取量的影響 隨著提取時間的延長，總黃酮提取量先增大后減小，時間為30min時，提取量達最大值0.5816mg/g，這可能是由于超聲時間延長，總黃酮溶出量增加，當細胞中有效成分基本全部溶出時，提取量不再增加；提取時間繼續延長，提取量反而下降，這可能是由于超聲時間過長，黃酮類化合物的結構遭到破壞，導致總黃酮提取量下降[15]（圖4）。因此將優化時間設定為20、30、40min。

2.2 響應面法優化油橄欖果總黃酮提取工藝

2.2.1 響應面實驗設計及結果 根據表2進行實驗，采用design expert 8.0軟件對所得數據進行多元回歸擬合，得模型表達式：

圖4 超聲時間對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Results of response surface experiments

對 該 模 型 采 用 方 差 分 析（analysis of variance，ANOVA），分析結果見表3。結果顯示模型極顯著（p＜0.01），失擬項不顯著（p＞0.05），相關系數R2=0.9493，說明該模型對實驗擬合度較好，可用于油橄欖果總黃酮提取實驗的預測。另外，該模型的變異系數C.V為5.14%，在可接受范圍內。A、B、C、A2、C2、D2影響極顯著，D、BD、CD影響顯著，表明各實驗因素對總黃酮提取量的影響不是簡單的線性關系。

表3 響應面回歸方程的方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

圖5 超聲時間和甲醇濃度對總黃酮提取量影響的響應面圖Fig.5 Response surface of ultrasonic time and methanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

圖6 超聲時間和超聲溫度對總黃酮提取量影響的響應面圖Fig.6 Response surface of ultrasonic time and ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids

2.2.2 響應面分析 根據回歸方程，做出交互項顯著的響應曲面圖和等高線圖，如圖5、圖6所示。等高線的形狀可以反映出交互作用的強弱，橢圓形表明交互作用顯著，而圓形則與之相反，有閉合的橢圓或圓形則表明有極大值[16]。通過方差分析及響應面分析可知，在本實驗中，料液比和甲醇濃度是影響油橄欖總黃酮提取的最重要的兩個因素，次之是超聲溫度，超聲時間影響最小；甲醇濃度、超聲溫度分別與超聲時間的交互作用對油橄欖總黃酮提取量的影響顯著，而其他因素的交互作用不顯著。

2.2.3 驗證實驗 依據回歸模型，確定超聲波輔助提取油橄欖果總黃酮的最佳條件為料液比1∶22.92（g/mL）、甲醇濃度80%、溫度47.95℃、時間29.73min，在此條件下，預測油橄欖鮮果總黃酮提取量達0.8616mg/g。

為了檢測真實值是否與實驗預測值一致，根據得到的最佳提取條件進行驗證實驗，考慮實際操作的便利，將最佳工藝條件修改為料液比1∶23（g/mL）、甲醇濃度80%、超聲溫度48℃，超聲時間30min，在此條件下進行三次重復實驗，實際測得的總黃酮提取量的平均值為0.8567mg/g，其相對誤差約為0.57%，與理論預測值相接近，表明建立的模型可以較好地模擬和預測油橄欖總黃酮的提取效果。

2.3 不同成熟度的油橄欖果中總黃酮含量的變化

由圖7可知，油橄欖果實隨成熟度的增加，其總黃酮含量呈現先下降后略有上升的變化趨勢，這與桑葚[17]和蘋果[18-19]中的研究結果相似。在整個成熟過程中，第一成熟度的總黃酮含量均為最高，第四、五成熟度時含量降至最低，第六成熟度略有上升；總黃酮含量最高為克羅萊卡的第一成熟度3.9042mg/g，最低為云臺的第四成熟度0.7189mg/g；變化幅度最大為克羅萊卡3.1739mg/g，最小為配多靈0.8533mg/g；鄂植和配多靈的總黃酮含量從第三成熟度開始均顯著高于其他品種，第四成熟度時含量達最低，分別為1.4736mg/g和1.2831mg/g。植物黃酮類生物合成的直接前體物質為丙二酸單酰、香豆酰，而這兩種前體分別與糖代謝、脂質代謝以及氨基酸代謝有關[20]，這可能是導致總黃酮含量在油橄欖成熟過程中大量下降的主要原因。油橄欖果實在成熟過程中，果皮顏色由青綠轉為黃綠，再變成少半紫、多半紫、全紫直至黑紫，果肉顏色由綠轉為黃綠、白色、少半紫、多半紫、全紫。花色苷類物質的合成受類黃酮-3-O-葡萄糖基轉移酶（UFGT）的催化，研究發現UFGT酶在草莓果實發育的全紅期活性較高[21]。由此推測，油橄欖果皮和果肉轉紫過程中總黃酮含量略有增加，也可能與花色苷類物質的合成有關。油橄欖果中黃酮類化合物的積累、轉化、降解是一個復雜的過程，其機理還有待進一步的深入研究。

圖7 油橄欖不同品種果實中總黃酮提取量隨成熟度的變化Fig.7 Changes in the extraction yield on total flavonoids of olive fruits during ripening stages

3 結論

3.1 單因素實驗結果表明，油橄欖鮮果總黃酮提取量隨著甲醇濃度、超聲溫度、超聲時間的增加呈現先升高后下降的趨勢，而隨著料液比的增大，呈現為先升高后趨于平穩。

3.2 通過單因素實驗和Box-Behnken實驗設計并結合響應面分析進行提取優化，得到最佳提取工藝為料液比1∶23（g/mL）、甲醇濃度80%、超聲溫度48℃，超聲時間30min，在此條件下，油橄欖鮮果總黃酮提取量可達0.8567mg/g。

3.3 在整個成熟過程中，油橄欖果實總黃酮含量呈現先下降后略有上升的變化趨勢；總黃酮含量最高為克羅萊卡的第一成熟度3.9042mg/g，最低為云臺的第四成熟度0.7189mg/g；鄂植和配多靈從第三成熟度開始總黃酮含量顯著高于其他品種，第四成熟度時達最低，分別為1.4736mg/g和1.2831mg/g。

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Optimization of extraction for total flavonoids from olive fruit and its changes at different ripening stages

DENG Jun-lin1，WANG Han-dong1，LIU Lu1，DING Chun-bang1，*，LI Tian2，YANG Ze-shen3
（1.College of Life and Basic Sciences，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.College of Agronomy，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；3.Liangshan Zhongze New Tech Development Co.，Ltd.，Xichang 615000，China）

Response surface methodology was employed to optimize the extraction process of total flavonoids in fresh olive fruit assisted by ultrasonic.And the contents of total flavonoids in picual，frantoio，koroneiki，kaliniot，ezhi，yuntai，pendolino and coratina with six maturities were measured.The aim of the extraction process was to examine the extraction parameters such as solid-liquid ratio，methanol concentration，ultrasonic temperature and ultrasound time，and to obtain the best possible combinations of these parameters for maximizing extraction yield of total flavonoids through response surface methodology （RSM） on the basis of single factor experiments.The results showed that the optimal extraction conditions were as follows ： solid-liquid ratio 1∶23（g/mL），methanol concentration 80%，ultrasonic temperature 48℃，ultrasonic time 30min.Under this optimum condition，the yield of total flavonoids in olive fruit was 0.8567mg/g.The contents of total flavonoids in eight olive varieties with maturity increasing had slight increase after an initial decline.The highest yield of total flavonoids was ‘koroneiki’（3.9042mg/g） at the first maturity，and the lowest one was ‘yuntai’（0.7189mg/g） at the fourth maturity.The yield of total flavonoids in ezhi and coratina were significantly higher than other varieties after the third maturity.

olive；total flavonoids；response surface methodology（RSM）；ultrasonic-assisted；ripening stage

TS201.1

B

1002-0306（2014）22-0254-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.047

2014－03－11

鄧俊琳（1988-），女，碩士研究生，研究方向：油橄欖優良品種選育。

* 通訊作者：丁春邦（1966-），女，教授，主要從事植物學教學與科研工作。

四川省科技廳科技支撐計劃項目（2013NZ0047）。