蕎麥米多酚物質的提取及其抗氧化特性

謝鳳英，張秀玲，程 雪，校顏玲，李賽男

（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030）

蕎麥米多酚物質的提取及其抗氧化特性

謝鳳英，張秀玲*，程 雪，校顏玲，李賽男

（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030）

為了獲得乙醇提取蕎麥米多酚物質的最佳工藝參數，以提取溫度、時間、乙醇濃度及料液比為實驗因子，以多酚物質得率為響應值，采用響應面設計進行實驗。并對優化后蕎麥米提取物粉末的抗氧化特性進行了分析。結果表明，影響蕎麥米多酚物質得率因素強弱順序依次為：料液比＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間，蕎麥米多酚物質提取最優條件為提取溫度56℃、提取時間6.0h、料液比1∶12g/mL、乙醇濃度65%。2mg/mL蕎麥提取物對羥自由基在反應時間為20min時具最強清除活性，其清除率為26.88%；對DPPH·的清除在反應時間為30min時，清除率最高，為43.65%；在反應時間為10min時，3mg/mL蕎麥提取物表現出最大的還原力，其值為2065.39。

蕎麥米，多酚，提取，響應面，抗氧化

現代醫學研究表明，氧化損傷是導致許多慢性病，如心血管病、癌癥和衰老性疾病的重要原因，多酚物質的抗氧化功能可以對這些慢性病起到預防作用[1]。蕎麥作為雜糧作物之一，已被證明具有抗氧化活性[2-4]，其含有的黃酮醇苷分別為蘆丁、槲皮素、山奈酚-3-蕓香糖苷和黃烷醇[5]。與大多數水果、蔬菜和糧食作物相比，蕎麥中含有較多的蕓香苷，其中槲皮素-3-蕓香糖苷具有抗氧化、抗炎和抗癌作用并且還可以降低與人血管的脆性有關的出血疾病和高血壓[6-7]。隨著研究的深入，蕎麥多酚的抗感染、抗突變、抗腫瘤等作用也被人們所認知。因此，蕎麥抗氧化功能越來越受到人們的重視，并成為了研究的熱點[8-9]，但以往的研究多以蕎麥為研究對象，而未對蕎麥可食部分-蕎麥米中的多酚物質含量和抗氧化特性展開專門研究。因此，本實驗通過對蕎麥米中多酚物質提取條件及其抗氧化特性的研究，以期為蕎麥米抗氧化保健功能食品的開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕎麥米 遼寧省阜新化石戈谷業有限責任公司提供，粉碎后60目過篩，低溫冰箱保存備用；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、福林酚試劑 Sigma公司進口分裝；沒食子酸、碳酸鈉、30%過氧化氫、硫酸亞鐵、無水乙醇 均為國產分析純。

高速萬能粉碎機 興市科宏儀器有限公司；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器金壇市醫療儀器廠；SC-3614低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；722S可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；旋轉蒸發儀R-1005 鄭州長城科工貿有限公司；電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；酸度計 杭州奧立龍儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實驗儀器廠。

1.2.1 蕎麥米多酚物質乙醇提取 準確稱取10.0g蕎麥米粉于燒杯中，按照工藝優化實驗設計的因素水平條件進行乙醇提取。提取后4000r/min離心15min取上清液，于旋轉蒸發儀上真空濃縮后，定容至25mL，即為蕎麥米多酚物質的提取液。

1.2.2 多酚物質含量測定 采用Folin-ciocalteu法[10]，以沒食子酸作為標準物。

1.2.3 多酚物質得率的計算 多酚物質提取效果以得率為考察指標，得率為提取液中多酚物質的質量與物料質量之比，計算公式如下：

式中：Y—多酚物質得率，%；m—提取液中多酚物質的質量，g；M—干物料的質量，g。

1.2.4 蕎麥米提取物抗氧化特性 按照優化后的最佳工藝條件提取蕎麥米中多酚物質，并將其減壓濃縮后，凍干，得蕎麥米提取物粉末[11]。通過測定不同濃度蕎麥米提取液對羥自由基、DPPH自由基及還原力隨時間的變化情況來確定蕎麥米多酚提取物的抗氧化特性。

1.2.4.1 羥 基 自 由 基（·OH）的 清 除 作 用 參 考SmimoffN和Cumbes[12]的方法。取若干10mL試管，依次加入8.0mmoL/L FeSO4溶液0.6mL，0.02moL/L H2O2溶液 0.5mL及 樣 品 溶 液 后 加 入 3.0mmoL/L 水 楊 酸 溶液2.0mL，于 37℃ 保 溫 30min，加 去 離 子 水 至 刻 度 ，4000r/min的轉 速 下離 心10mim，于510nm處 測 定 吸光值。以多酚提取物抑制·OH引發的水楊酸羥基化作用的程度表示其清除·OH的能力。計算公式如下：

應用R軟件對數據進行統計分析，利用x2檢驗、Logistic回歸和非參數Kruskal-Wallis檢驗對不同種類醬油、不同采樣地點、不同生產季度等的污染情況進行比較，以α=0.05為檢驗水準。

式中：A0—未加清除劑（多酚提取物）的吸光值，A1—加入清除劑的吸光值，A2—試劑空白（未加水楊酸）的吸光值。

1.2.4.2 DPPH自由基（DPPH·）的清除作用 參照Sahreen等[13]的方法進行。20mg DPPH·溶于100mL甲醇中得DPPH·儲液。甲醇稀釋DPPH·儲液至517nm下吸光值為0.870±0.02得DPPH工作液。3mL DPPH·工作液與100μL樣品液反應30min，517nm處測定吸光值，3mL DPPH工作液與100μL甲醇反應作對照。樣品對DPPH·的清除率按下面的公式計算：

式中：A0—3mL DPPH溶液與100μL甲醇反應的吸光值，A1—3mL DPPH溶液與100μL樣品反應的吸光值。

1.2.4.3 還 原 力 的 測 定 參 照 Thiansilakul等[14]的 方法進行。取0.2mL樣品液于離心管中，分別加入2mL磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH6.6）和1%鐵氰化鉀溶液2mL，混勻，于50℃反應20min，迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2mL終止反應，轉速4000r/min下離心10min。取上清液2mL，加入2mL蒸餾水，再加入0.5mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻，于暗處反應10min，700nm處測定吸光值。計算公式如下：

式中：A1—樣品與各試劑反應的吸光值，A0—試劑空白的吸光值。

1.2.5 實驗設計 通過單因素預實驗可知，隨著溫度的升高，蕎麥多酚物質得率逐漸增加，當溫度達到55℃時多酚得率達到最高值0.32%。其后隨著溫度的提高，其多酚物質得率降低；多酚物質得率在提取時間為6.0h時達到最高值0.39%；當料液比為1∶12g/mL時，多酚物質得率達到最高值0.38%，其后多酚物質得率趨于穩定；乙醇溶液濃度的增加，蕎麥多酚得率不斷增加，當乙醇濃度達到70%時，蕎麥多酚得率最高為0.27%。因此，在實驗選擇的條件下，響應曲面設計時零水平分別為提取溫度55℃、提取時間6.0h、料液比1∶12和乙醇濃度70%。

在單因素實驗基礎之上，選取提取溫度、提取時間、料液比和乙醇濃度為4個影響因素，以多酚物質得率為響應值，根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理[15]，設計四因素三水平實驗，其因素水平表見表1。

表1 Box-Benhnken設計實驗因素水平及編碼Table 1 Level and code of variables for Box-Benhnken design

1.3 數據處理

每個結果重復處理3次，所測數值均以平均值表示，采用Design Expert7.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 模型建立

Box-Benhnken實驗設計及結果如表2所示。利用Design Expert對表2中的實驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得多酚物質得率Y對提取溫度X1、提取時間X2、料液比X3和乙醇濃度X4的多元回歸方程：

多酚物質得率二次回歸方程方差分析結果見表3。由表3中的方差分析結果表明，方程具有極顯著性（p＜0.0001），其決定系數R2為0.9176。逐項顯著性檢驗結果表明，一次項、交互項、二次項中除了交互項X1X3和X1X4外，其余項均達到顯著性水平，模型失擬p=0.8790＞0.05，不顯著，說明該二次模型能夠擬合真實的實驗結果。

2.2 多酚物質得率的響應曲面分析與優化

利用Design Expert對表2中的實驗數據進行二次多項回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應曲面和等高線圖如圖1~圖6所示。

表2 Box-Benhnken設計表及實驗結果Table 2 Box-Benhnken design matrix and experimental results

由圖1可知，當乙醇濃度為70%，料液比為1∶12時，提取溫度不變，隨著提取時間的延長，多酚物質的得率先增加，當時間達到一定值后，趨于穩定。當提取時間恒定，提取溫度在50~60℃范圍內，多酚物質的得率先增加，達到極大值，隨后緩慢下降。

圖1 提取溫度和提取時間對多酚物質得率交互影響的曲面圖Fig.1 The 3-D surface plot of extraction temperature and time interaction on yield of total polyphenols

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental result

由圖2可知，當乙醇濃度為70%、提取時間為6h時，提取溫度不變，隨著料液比的增加，多酚物質的得率先增加后降低。當料液比恒定，多酚物質的得率隨提取溫度的變化是先增加，達到極大值，隨后緩慢下降。

圖2 提取溫度和料液比對多酚物質得率交互影響的曲面圖Fig.2 The 3-D surface plot of extraction temperature and sample-to-solvent ratio interaction on yield of total polyphenols

由圖3可知，當料液比為1∶12、提取時間為6h時，提取溫度不變，隨著乙醇濃度的增加，多酚物質的得率先增加，當乙醇濃度達到一定值后，趨于穩定并略有下降。當乙醇濃度恒定，多酚物質的得率隨提取溫度的變化是先增加，達到極大值，隨后緩慢下降。

由圖4可知，當乙醇濃度為70%、提取溫度為55℃時，提取時間較小時，隨著料液比的增加，多酚物質的得率逐漸減小；當提取時間較長時，隨料液比增加，多酚物質得率先增后趨于穩定。當料液比恒定，多酚物質的得率隨提取時間的延長是先增加，達到極大值，隨后趨于平衡。

圖3 提取溫度和乙醇濃度對多酚物質得率交互影響的曲面圖Fig.3 The 3-D surface plot of extraction temperature and ethanol concentration interaction on yield of total polyphenols

圖4 提取時間和料液比對多酚物質得率交互影響的曲面圖Fig.4 The 3-D surface plot of extraction time and sample-tosolvent ratio interaction on yield of total polyphenols

由圖5可知，當料液比為1∶12、提取溫度為55℃時，提取時間不變，隨著乙醇濃度的提高，多酚物質的得率先略有增加后降低。當乙醇濃度一定，多酚物質的得率隨提取時間的延長是先小幅增加，達到極大值后降低。

圖5 提取時間和乙醇濃度對多酚物質得率交互影響的曲面圖Fig.5 The 3-D surface plot of extraction time and ethanol concentration interaction on yield of total polyphenols

由圖6可知，當提取時間為6h、提取溫度為55℃時，料液比不變，隨著乙醇濃度的提高，多酚物質的得率降低。當乙醇濃度一定，多酚物質的得率隨料液比的增加，先增加達到極大值后逐漸下降。

由回歸方程、各實驗因素對多酚物質得率的相應曲面及方差分析可知，提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度對多酚物質得率的線性效應及曲面效應皆顯著（p＜0.05）；線性效應中影響多酚物質得率的強弱順序為：料液比＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間；提取溫度和時間、提取時間和料液比、提取時間和乙醇濃度、料液比和乙醇濃度對多酚物質得率的交互作用顯著。

圖6 料液比和乙醇濃度對多酚物質得率交互影響的曲面圖Fig.6 The 3-D surface plot and sample-to-solvent ratio and ethanol concentration interaction on yield of total polyphenols

圖7 蕎麥米提取物對羥自由基清除能力Fig.7 Hydroxide radical scavenging activity of buckwheat extraction

2.3 蕎麥米多酚最適提取工藝參數的確定及驗證

通過對擬合二次回歸方程求偏導并令其等于零，求得蕎麥多酚類物質提取最優條件為：提取溫度（X1）55.65℃ 、提 取 時 間（X2）6.02h、料 液 比（X3）1 ∶12g/mL、乙 醇 濃 度（X4）65.06%，此 時 多 酚 物 質 得 率 為0.46%?？紤]到實際操作性，校正理論數據為：提取溫度（X1）56℃ 、提 取 時 間（X2）6.0h、料 液 比（X3）1 ∶12g/mL、乙 醇濃度（X4）65%，三次驗證實驗得多酚物質得率為0.48%，與預測值相差3.48%。誤差率在合理的范圍之內，說明該響應曲面優化得到最佳工藝條件參數是可靠的。

2.4 抗氧化特性的測定結果

2.4.1 對·OH的清除作用 蕎麥米提取物對·OH清除作用結果見圖7。由圖7可以看出，三種不同濃度的蕎麥提取物對·OH清除作用隨時間的變化規律是：1mg/mL和2mg/mL蕎麥提取物對·OH清除率隨時間的延長而增加，在20min時清除率達到最大，分別為21.27%和26.88%，其后隨著時間的延長而降低并趨于平穩。3mg/mL蕎麥提取物對·OH清除率在10min處達到最大值24.58%后隨時間的延長先降低后又有所增加。從中可以看出，在Fenton反應中H2O2與二價鐵離子混合后產生·OH在30min左右完成，在這段時間內，3mg/mL蕎麥提取物由于其濃度高，因而對·OH的清除作用發生前置現象。而在30min之后，對·OH的清除作用只與蕎麥提取物的濃度呈正相關性。

2.4.2 對DPPH·的清除作用 蕎麥米提取物對DPPH·的清除作用結果見圖8。由圖8可以看出，三種不同濃度的蕎麥提取物對DPPH·的清除能力隨著時間的延長而逐漸增加，在30min達到最高后降低，而后又在60min處達到另一極大值。但其也存在著差異，30min時，三個濃度中2mg/mL清除率最大為43.65%，但在60min時3mg/mL清除率最大為43.67%。這一測定結果與Zhang和Tong[16]發現的自由基反應達到穩定狀態的時間與抗氧化劑和DPPH·的濃度比不成線性關系的觀點相一致。

圖8 蕎麥米提取物對DPPH自由基的清除能力Fig.8 DPPH radical scavenging activity of buckwheat extraction

2.4.3 還原力的測定 還原力的測定結果見圖9。從圖9中可以看出，濃度為1mg/mL、2mg/mL和3mg/mL蕎麥米提取物還原力隨著時間的變化情況為：反應時間為10min時，其都表現出最大的還原力，依次為817.3、1396.2和2065.39，其后，隨著時間的延長，三種不同濃度的蕎麥提取物的總還原力全部降低。由此可見，作用一定時間后，蕎麥提取物濃度越高，還原能力越強，其抗氧化活性越大[17]。

圖9 蕎麥米提取物還原能力Fig.9 Reducing power of buckwheat extraction

3 結論

3.1 利用響應面法優化并建立了蕎麥米多酚物質提取最佳工藝條件為：提取溫度56℃、提取時間6.0h、料液比1∶12g/mL、乙醇濃度65%，此時蕎麥多酚物質得率為0.48%，實驗結果重復性較好。

3.2 蕎麥米多酚物質體外抗氧化活性實驗結果表明：2mg/mL蕎麥提取物對·OH在作用時間20min時表現出26.88%最大清除率，對DPPH·的清除在作用時間30min時清除率最大為43.65%；3mg/mL蕎麥提取物作用時間10min時表現出2065.39最大的還原力。

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Polyphenol extraction from buckwheat and its antioxidant activities

XIE Feng-ying，ZHANG Xiu-ling*，CHENG Xue，JIAO Yan-ling，LI Sai-nan
（School of Food College，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China）

To obtain the optimum parameter of polyphenol extraction from buckwheat，this paper took extracting temperature，time ，ethanol concentration and sample-to-solvent ratio as single factor，and the yield of total polyphenol as response value，applied response surface methodology trial to experiment.And the antioxidant activities of the optimized buckwheat extraction were analyzed.Results showed that the orders of each factor influenced the buckwheat polyphenol yield were as follows：sample-to-solvent ratio ＞ethanol concentration ＞extract temperature ＞extract time，and the optimized conditions were temperature 56℃ ，time 6.0h，sample-tosolvent ratio 1 ∶12g/mL，ethanol concentration 65%.The antioxidant activities of extracts obtained at optimal conditions were as follows：2mg/mL buckwheat extraction had the maximum capacity of scavenging of hydroxide radical at 20min ，the value was 26.88% ，and also had the maximum capacity of scavenging of DPPH· at 30min，the value was 43.65%.3mg/mL buckwheat extracts showed the maximum capacity of reducing power at 10min，the value was 2065.39.

buckwheat；polyphenol；extraction；response surface methodology；antioxidant

TS210.4

B

1002-0306（2014）22-0259-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.048

2014－02－25

謝鳳英（1975-），女，博士，講師，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白質工程。

* 通訊作者：張秀玲（1968-），女，教授，研究方向：農產品貯藏加工。