響應面法優化超聲輔助醇提黃芪黃酮最佳工藝

曹 勇，馬艷梅，商雪嬌，吳曉光，*

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118；2.黑龍江職業學院，黑龍江雙城 150111；3.長春迪瑞醫療科技股份有限公司，吉林長春 130012）

響應面法優化超聲輔助醇提黃芪黃酮最佳工藝

曹 勇1，馬艷梅2，商雪嬌3，吳曉光1，*

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118；2.黑龍江職業學院，黑龍江雙城 150111；3.長春迪瑞醫療科技股份有限公司，吉林長春 130012）

采用超聲輔助醇提法提取黃芪中的黃酮，利用響應面法對黃芪黃酮提取工藝進行優化。在單因素實驗基礎上，通過響應面法對影響黃芪黃酮提取得率的乙醇濃度、料液比、提取溫度、超聲時間四個因素進行優化，確定最佳工藝條件為：乙醇濃度60%、料液比1∶20（g∶mL）、提取溫度76℃、超聲時間30min，黃酮得率為3.30%。

黃芪，黃酮，響應面法，提取工藝

黃芪為豆科植物膜莢黃芪的干燥根，是當前中醫臨床處方和中成藥中用量最大的中藥之一，藥界素有“十藥八芪”之稱，也是出口的大宗品種[1]。黃芪的有效成分主要是黃芪多糖、黃芪皂甙和黃酮類，此外還有氨基酸、生物堿、有機酸、硒等化學成分。黃芪中的黃酮或黃酮類似物約二十種左右，大多屬于黃酮、異黃酮和異黃烷類化合物。黃酮類化合物是一種很強的抗氧化劑，可有效清除體內的氧自由基，阻止細胞的退化、衰老，也可以阻止癌癥的發生，改善血液循環，降低膽固醇，抑制炎性生物酶的滲出，增進傷口愈合和止痛[2-3]。

黃酮類化合物的提取方法主要有水提法、有機溶劑提取法、超臨界萃取、超聲波法、微波法等[4-8]。在各 種 提 取 方 法 中 運 用 響 應 面 法（Response Surface Methodology）建立連續變量曲面模型，對實驗的各個水平進行分析，確定最佳水平范圍，可達到優化提取方法，建立最佳提取工藝的目的[9]。目前，對黃芪中總黃酮的提取工藝研究中超聲波輔助醇提取研究較少，研究黃芪中總黃酮最佳提取工藝條件，對于黃芪新藥和功能性食品的開發具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁（Rutinum）標準品 北京藥品生物制品鑒定；內蒙黃芪 購自吉林大藥房；乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鈉、硝酸鋁 等均為分析純。

高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；SCOUTSCA210型電子天平 梅特勒·托利多常州衡器有限公司；SYC-15B超級恒溫水浴鍋 南京桑力電子設備廠；KQ5200DB型數控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；UV-120型可見分光光度計 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮的測定方法 將片狀黃芪在60℃下干燥、粉碎后，過30目篩。精密稱取10.0000g置于具塞錐形瓶中，加入實驗條件設定的乙醇量，密塞，在一定溫度水浴中超聲提取一定時間，放冷，過濾。總黃酮的測定采用分光光度法，樣品中黃酮類化合物進行提取純化后，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[10]處理，于510nm波長下測定其吸光度，與蘆丁標準品比較，進行定量。

1.2.2 蘆丁標準曲線的制備 準確稱取蘆丁標準品20mg，置100mL量瓶中，60%乙醇溶液定容至100mL，得到0.2mg/mL的蘆丁標準液。

精 密 吸 取0.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL 蘆丁標準液，加入60%乙醇4mL，5%的亞硝酸鈉0.4mL，搖勻靜置6min，加入10%的硝酸鋁0.4mL，搖勻靜置6min，加入4%的氫氧化鈉4mL，用60%的乙醇定容至25mL，搖勻靜置25min。在510nm條件下測其吸光度，以質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為y=0.0124x+0.0086，相關系數R2= 0.9991，結果表明吸光度與質量濃度線性關系良好。取適量樣品溶液按標準曲線制作方法測定吸光度，通過標準曲線計算樣品中黃酮含量。

式中，C為由標準曲線計算樣品濃度（mg/mL）；M為原料干重（mg）；V1為取樣體積（mL）；V2為測試用樣品體積（mL）。

1.2.3 單因素實驗設計

1.2.3.1 乙醇濃度的確定 準確稱取黃芪粉末10.00g，按 料 液 比1∶20（g∶mL）加 入 乙 醇 濃 度 分 別 為 40% 、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液，70℃超聲提取30min。

1.2.3.2 料液比的確定 準確稱取黃芪粉末10.00g，按料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）加入60%乙醇水溶液，70℃超聲提取30min。

1.2.3.3 提取溫度的確定 準確稱取黃芪粉末10.00g，按料液比1∶20（g∶mL）加入60%乙醇水溶液，分別在40、50、60、70℃、80℃水浴中超聲提取30min。

1.2.3.4 超聲時間的確定 準確稱取黃芪粉末10.00g，按料液比1∶20、提取溫度70℃、超聲提取時間分別為10、20、30、40、50min。

1.2.4 響應面實驗設計 在單因素實驗基礎上，利用Design-Expert 8.0.7.1軟件進行響應面設計。實驗方案及結果見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and coded levels of response surface analysis

1.3 數據處理

用Design-Expert 8.0.7.1 軟 件 程 序 ，根 據 Box-Behnken實驗設計原理，采用四因素三水平的響應面分析法，以總黃酮得率為響應值對提取條件進行優化。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果及分析

2.1.1 乙醇濃度對黃酮得率的影響 由圖1可知，黃酮的得率隨乙醇濃度的增加呈先增大而后降低的趨勢。當濃度達到60%時，黃酮得率為2.68%，達到最大。當乙醇濃度再增加時，得率略有下降，這是由于黃酮類化合物是一大類極性范圍很廣的物質，一定量乙醇的加入使醇溶性和水溶性的總黃酮都能最大程度的溶出，當溶液的極性過高和過低時，都會降低黃酮類化合物的溶出，導致總黃酮的提取率下降。故本實驗選擇最佳乙醇濃度為60%。

圖1 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.1 Ethanol concentration effect on the yield of flavonoids

2.1.2 料液比對黃酮得率的影響 由圖2可以看出，料液比太小，不能保證原料中的黃酮全部轉移到液相中，提取得率較低；黃酮得率隨料液比增加而增大，料液比為1∶20（g∶mL）時的黃酮得率為2.55%。當料液比大于1∶20（g∶mL）后，黃酮得率增加不明顯。故選擇最佳料液比1∶20（g∶mL）。

圖2 料液比對黃酮得率的影響Fig.2 Material liquid ratio on the yield of flavonoids

2.1.3 提取溫度對黃酮得率的影響 溫度的升高使分子擴散運動加快，有助于溶質的擴散和溶劑的滲透，有利于黃芪黃酮物質的溶出。由圖3可以看出，提取溫度低于70℃時，隨提取溫度的升高，黃酮得率較快增大，可達到70℃時2.75%。而溫度過高，其中的活性成分易受到破壞，雜質的溶出量增加，給后續操作帶來不便，成本費用增大，綜合考慮，選擇最佳提取溫度為70℃。

圖3 溫度對黃酮得率的影響Fig.3 Temperature effect on the yield of flavonoids

2.1.4 超聲時間對黃酮得率的影響 提取的傳質過程需要一定時間才能達到平衡，超聲波可以加快傳質過程，時間太短，還未達到平衡，其得率就偏低；當傳質過程達到基本平衡后，得率就不會明顯上升。由圖4可知，黃芪黃酮得率隨超聲時間的延長而增大，提取時間30min時，黃酮得率達到最大值，30min后基本達到平衡。從時間效益考慮，選擇最佳超聲時間30min。

圖4 超聲時間對黃酮得率的影響Fig.4 Ultrasonic effect on the yield of flavonoids from time

2.2 響應面優化實驗分析

按表1進行響應面實驗，共27個實驗點，其中1~ 24號為析因實驗，25~27為中心實驗。實驗方案及結果見表2。對實驗結果回歸擬合，得該模型對應的回歸方程為：

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 方差分析Table 3 Variance analysis for the developed regression model

由Design-Expert 8.0.7.1軟件對二次回歸方程進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，二項式擬合模型方程失擬性（p＞0.05），符合模型要求，回歸模型達到極顯著水平（p＜0.01），說明該方程擬合度良好，可利用該模型分析最佳提取工藝條件。由表3中F值的大小可以判斷各因素對類黃酮提取率影響的強弱。F值越大，影響作用越強。各個因素對類黃酮提取率影響的程度大小的次序為提取溫度＞超聲時間＞料液比＞乙醇濃度，其中提取溫度對總黃酮提取率的影響達到極顯著水平（p＜0.0001）。

2.3 響應曲面分析

為了考察交互項對多糖得率的影響，在兩個因素固定不變的情況下，對模型進行降維分析，經Design-Expert 8.0.7.1軟件處理得到響應面及等高線。根據所得模型經響應面回歸分析，得出最佳提取條件為：乙醇 濃 度 58.97% 、料 液 比 1 ∶18.97（g ∶mL）、提 取 溫 度76.11℃、超聲時間27.08min，此時黃酮得率為3.35%。考慮到實際操作的可靠性，將實驗結果進行修正，即乙醇濃度60%、料液比1∶20（g∶mL）、提取溫度76℃、超聲時間30min，此條件下黃酮得率可達到3.30%。

3 結論

在單因素基礎上，通過Box-Behnken實驗，建立回歸方程，經響應面回歸分析得到優化組合條件為：即乙醇濃度60%、料液比1∶20（g∶mL）、提取溫度76℃、超聲時間30min，此條件下黃酮得率可達到3.30%。

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Optimization of ultrasonic assisted alcohol extraction process of flavonoids from Radix Astragali by response surface methodology

CAO-Yong1，MA Yan-mei2，SHANG Xue-jiao3，WU Xiao-guang1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Heilongjiang Vocational College，Shuangcheng 150111，China；3.Changchun DIRUI Medical Technology Co.，Ltd.，Changchun 130012，China）

Response surface methodology was used to optimaize the ultrasonic assisted alcohol extraction of flavonoids from Radix Astragali.On basis of single factor experiment，optimize the ethanol concentration，solidliquid ratio，extraction temperature，and ultrasonic time which influence the yield of flavonoids.The optimum technological conditions were determined as follows ：the ethanol concentration 60% ，solid-liquid ratio 1 ∶20（g∶mL），extraction temperature 76℃，ultrasonic time 30min，and the flavonoids yield was 3.30%.

Radix Astragali；flavonoids；response surface methodology；extraction process

TS201.1

B

1002-0306（2014）22-0278-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.052

2014－04－11

曹勇（1976-），女，博士，講師，主要從事食品分析及功能性食品方面的研究。

* 通訊作者：吳曉光（1973-），女，碩士研究生，副教授，主要從事動物性食品加工方面的研究。