脈沖強光對糙米發芽過程積累GABA條件的優化

王 勃，馬 濤，惠麗娟，劉 賀，何余堂

（渤海大學化學化工與食品安全學院，渤海大學糧油科學與技術研究所，遼寧錦州 121013）

脈沖強光對糙米發芽過程積累GABA條件的優化

王 勃，馬 濤，惠麗娟，劉 賀，何余堂

（渤海大學化學化工與食品安全學院，渤海大學糧油科學與技術研究所，遼寧錦州 121013）

通過脈沖強光技術促進糙米發芽過程富集GABA，并采用響應面方法確定了其最佳處理條件：浸泡12h后，對單層糙米進行脈沖強光照射，單次能量400J、閃照次數277次、閃照距離11.3cm，此條件下發芽糙米中GABA含量可達到345.7mg/100g。

發芽糙米，GABA，脈沖強光，響應面

糙米具有完整的生命活力，在適宜水分和溫度條件下就能發芽[1]。在糙米發芽過程中GABA在磷酸吡 哆 醛（PLP）等 輔 酶 作 用 下[2]，經 谷 氨 酸 脫 羧 酶（GAD）催化L-谷氨酸（L-Glu）脫羧生成，而谷氨酸的生成依靠蛋白酶分解蛋白質，然后經谷氨酸代謝轉化得到。發芽糙米中γ-氨基丁酸（GABA）含量與GAD的活性大小呈顯著正相關[3]。在機械損傷、溫度應激、高酸度、厭氧、干旱、黑暗和蟲害等逆境條件下，植物體內GAD的活性升高，導致GABA積累，積累的GABA反過來則會刺激細胞，加大植物體對逆境的適應，這是植物在抵抗昆蟲斗爭、組織受損和溫度脅迫等逆境中的重要應激反應。研究表明[4]，蟲害、擠壓、研磨等機械損傷，微波、紅外、冷凍等溫度應激的逆境條件都會導致胞內結構破壞，使細胞質pH降低、鈣離子水平增加，使得與CaM相關的基因表達在環境應激中受到調節，從而激活谷氨酸脫羧酶引起GABA含量的增加。脈沖強光的波長范圍從紫外光到近紅外光，其中至少有70%的電磁能來自波長為170～2600nm的光線，具有光熱、光化學效應[5]。脈沖強光處理脈沖電場所產生的物理效應對GAD活性有促進作用，因此對富集GABA有一定促進作用。本研究在單因素實驗基礎上，進行響應面設計，得出脈沖強光處理發芽糙米富集GABA最佳工藝條件，為實際生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試糙米 中稻股份有限公司，品種為遼星1號；GABA標準品 Sigma公司；谷氨酸鈉（MSG，味精，谷氨酸鈉＞99%，無鹽） 中外合資武漢味全食品有限公司；次氯酸鈉 分析純，有效氯為9%，廣東汕頭市西隴化工廠；重蒸苯酚 分析純，武漢天源生物技術有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硼砂、硼酸和無水乙醇 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

脈沖強光表面殺菌實驗柜 寧波中物光電殺菌技術有限公司；HH.B11-500電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠；HH-601A超級恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫療儀器廠；UV1200型紫外可見分光光度計 上海正慧工貿有限公司；PB-20標準pH計 北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發芽糙米的生產工藝流程 將精選后的糙米用1.0%的次氯酸鈉溶液浸泡5min，加入量以剛好淹沒糙米為宜，下同[6]，自來水沖洗3遍，加入4倍體積的水，30℃浸泡12h。糙米浸泡后用去離子水清洗，均勻地攤于鋪有四層紗布的培養皿中，其中紗布用營養液潤濕[7]。所用營養液為pH5.7的PBS緩沖溶（0.05mol/L），其中MSG濃度為2.1mg/mL。發芽過程每隔4h加入1mL營養液并上下翻動糙米，以保證糙米在發芽期間的濕潤狀態，31℃恒溫發芽25h。

1.2.2 脈沖強光參數介紹 工作電壓2800V，額定功率1kW，電源：AC220V±10%，內置石英板調節照射距離，共有六個高度可以調節。樣品輻照腔規格：480（mm）×400（mm）×270（mm）。處理時，將處理樣品置于燈管正下方石英板上即可。在閃照過程中，上下翻動糙米，使其照射均勻。

1.2.3 GABA含量的測定 參考姚森[8]的方法并加以改進，取2.5g發芽糙米，加適量蒸餾水研磨勻漿，然后定容至50mL，于30℃水浴中浸提2h，過濾后取濾液0.5mL，加入0.2mL 0.2mmol/L硼酸緩沖液（pH9.0），1mL 6g/100mL重蒸苯酚溶液，0.4mL有效氯含量9%的NaClO溶液，充分振蕩，置于沸水浴10min，再立即置于冰水浴中20min并不斷振蕩，待溶液出現藍綠色后，加2mL體積分數60%的乙醇溶液，再次振蕩均勻，靜置后于645nm波長處比色，測定其吸光度值A，通過GABA的標準曲線Y=0.1819X-0.0058（Y為GABA的濃度，mg/mL；X為A645，R2=0.998）求出GABA含量。

1.2.4 單因素實驗 考察脈沖強光單次能量、閃照次數、開始處理時間、物料厚度及閃照距離5個因素對糙米GABA的影響[9]。

1.2.4.1 單次能量對發芽糙米GABA含量的影響 糙米浸泡后，將單層糙米分別在單次能量為100、200、300、400、500J條件下閃照300次處理，閃照距離為11.3cm，以無脈沖強光處理為對照組，其他過程同“1.2.1”，以GABA含量為考察指標，下同。

1.2.4.2 閃照次數對發芽糙米GABA含量的影響 糙米浸泡后，將單層糙米在單次能量為400J條件下分別閃照100、200、300、400、500次處理，閃照距離為11.3cm，以無脈沖強光處理為對照組。

1.2.4.3 物料厚度對發芽糙米GABA含量的影響 將8、16、32g浸泡后的糙米（實驗中發現，剛好鋪滿培養皿所需糙米為8g左右）均勻鋪滿培養皿，視其料層厚度分別為1、2、4層，在單次能量為400J條件下閃照300次處理，閃照距離為11.3cm，以無脈沖強光處理為對照組，在處理過程中，適當翻動糙米，使其照射均勻。

1.2.4.4 閃照距離對發芽糙米GABA含量的影響 糙米浸泡后，將單層糙米在單次能量為400J條件下閃照300次處理，閃照距離分別為9.5、10.4、11.3、12.2、13.1、14.0cm，以無脈沖強光處理為對照組。

1.2.4.5 開始處理時間對發芽糙米GABA含量的影響 分別將浸泡前、浸泡后、發芽12h時的單層糙米在單次能量為400J條件下閃照300次處理，閃照距離為11.3cm，以無脈沖強光處理為對照組。

1.2.5 實驗條件優化 根據單因素實驗結果，由于物料厚度與GABA富集效果呈負相關，因此選取物料為8g，浸泡后進行脈沖強光處理效果明顯優于其他處理方法，因此選取浸泡后進行脈沖強光處理。因此將單次能量（A）、閃照次數（B）、閃照距離（C）三個因素與發芽糙米中GABA含量進行響應面實驗設計，優化糙米發芽工藝。根據Box-Behnken的中心組合設計原理[10]，通過Design Expert 8.0軟件對實驗數據進行分析，預測糙米發芽的最佳工藝條件。各因素及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗因素及水平Table 1 Three main induction conditions and their levels for Box-Behnken design

1.2.6 最佳發芽條件的驗證 根據優化實驗結果，采用Design Expert軟件求得回歸方程，以發芽糙米GABA含量最大化為目標，計算得到培養發芽糙米工藝參數和理論含量，將得到的工藝參數修正以便于操作后，進行驗證實驗，評價工藝參數的可靠性。

1.2.7 數據處理 應用Design-Expert 8.0軟件進行Box-Behnken中心組合實驗設計，進行數據的回歸和線性分析。數據經過分析后，通過軟件會得到3D圖和等高線圖，用作進一步分析研究。根據統計確定系數R2判斷多項式模型方程的質量。通過方差分析（ANOVA）來觀察顯著性，顯著性水平設置為p＜0.05。

2 結果與分析

2.1 單次能量對發芽糙米GABA含量的影響

圖1 單次能量對GABA含量的影響Fig.1 Effect of single energy on the GABA content

由圖1可以看出，脈沖強光處理對GABA含量的提高有一定促進作用。在一定范圍內，單次能量越高，GABA含量越高；在400J處理時，GABA含量達到最大值。脈沖強光處理后，不同單次能量處理分別比對照組提高了15.5%、31.0%、45.1%、64.0%、15.5%。一定閃照次數下，單次能量太高，會讓對糙米內部升溫很快，不利于酶活的提高；單次能量太低，酶活提高有限。本實驗條件下，單次能量400J較為適宜。

2.2 閃照次數對發芽糙米GABA含量的影響

圖2 閃照次數對GABA含量的影響Fig.2 Effect of flash number on the GABA content

由圖2可以看出，閃照次數不同，發芽糙米GABA含量不同；隨著閃照次數的升高，GABA含量呈現先上升后下降的趨勢；其中，閃照次數為300次時，種子內部酶活被適當的能量所激發使得GABA含量最高。少于或多于能量綜合都會降低GABA富集的含量。在單次能量固定的情況下，不同閃照次數的脈沖強光處理后，分別比對照組提高了9.4%、39.6%、64.0%、20.9%、2.8%。在實驗過程中，處理次數≥400次時，糙米表皮顏色明顯變深，影響糙米感官品質，其他處理糙米表皮無明顯加深。本實驗條件下，閃照次數為300次較為適宜。

2.3 物料厚度對發芽糙米GABA含量的影響

圖3 物料厚度對GABA含量的影響Fig.3 Effect of material thickness on the GABA content

由圖3可以看出，物料厚度不同，脈沖強光閃照處理對糙米GABA含量影響不同。隨著物料厚度的增加，發芽糙米中GABA含量逐漸降低；料層厚度為4層時，脈沖強光閃照處理后，糙米中GABA含量僅提高了17.2%。本實驗條件下，由于脈沖強光的穿透力較差，只對糙米表層組織有影響，因此單層糙米進行脈沖強光處理效果最佳。

2.4 閃照距離對發芽糙米GABA含量的影響

由圖4可以看出，在其他處理條件相同，閃照距離不同的情況下，發芽糙米GABA含量有所不同，呈現先上升后下降的趨勢；其中，閃照距離為11.3cm時，GABA含量最高。不同閃照距離的脈沖強光處理后，分別比對照組提高了43.5%、54.0%、64.0%、52.1%、 46.2%、33.9%。隨著閃照距離的加大，GABA含量先較快升高（可能是由于距離近脈沖強光能量過大造成種子內部酶活性的降低，從而影響GABA富集含量的降低）達到最高值又緩慢下降（可能是脈沖強光隨著閃照距離的增大，部分能量散失所導致）的趨勢。本實驗條件下，閃照距離為11.3cm較為適宜。

2.5 開始處理時間對發芽糙米GABA含量的影響

圖4 閃照距離對GABA含量的影響Fig.4 Effect of flash distance on the GABA content

圖5 開始處理時間對GABA含量的影響Fig.5 Effect of start processing time on the GABA content

由圖5可以看出，不同時間進行脈沖強光處理，對糙米GABA含量影響不同。在浸泡前對糙米進行一定強度的脈沖強光照射處理，由于GAD的活性還沒有被激活因此對糙米中GABA含量影響很小。浸泡后脈沖強光處理，糙米GABA含量提高了64.0%。而發芽12h后脈沖強光處理，可能是浸泡過程中種子中的GAD被分解并散失到浸泡液中造成流失，使糙米發芽時的GABA含量僅提高了26.4%，但是此時對糙米進行閃照處理，糙米表面顏色易變深，甚至造成胚芽的損傷。本實驗條件下，脈沖強光開始處理時間選擇在浸泡后較為適宜。

2.6 響應面分析法優化脈沖強光處理條件結果分析

2.6.1 實驗因素水平編碼與實驗結果 應用Design-Expert 8.0軟件進行Box-Behnken中心組合實驗設計，分別在相應的脈沖強光處理條件下進行糙米浸泡發芽培養，以發芽糙米中GABA含量為響應值（Y），進行響應面實驗，實驗設計及結果如表2所示[11]。

2.6.2 回歸模型的建立及統計分析 根據表2的實驗結果，通過Design Expert 8.0軟件處理確定回歸方程，該實驗的回歸方程為：

Y=347.6-14.33A-17.55B-4.78C-40.6AB-5.75AC-12.75BC-53.2A2-33.1B2-28.15C2

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Test design and results of Box-Behnken design

回歸模型進行方差分析及可信度分析結果見表3。

根據α=0.05顯著水平剔除不顯著項，簡化后的回歸方程為：Y=347.6-14.33A-17.55B-40.6AB-12.75BC-53.2A2-33.1B2-28.15C2

根據表3可知，該回歸模型顯著（p=0.0002），除了方程的一次項C和交互項AC影響不顯著，交互項BC影響顯著外，其他均極顯著，且該模型極顯著（p＜0.01）。因變量與自變量之間的線性關系顯著（R2= 0.9906），模型調整復相關系數R2adj=0.9735，說明該模型能解釋97.35%響應值的變化，擬合程度較好[12]。失擬項不顯著（p＞0.05），說明本實驗所得二次回歸方程能很好地對響應值進行預測[13]。

圖6 各兩因素交互作用對GABA含量影響的響應曲面Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of pairwise interactions among various process conditions on the GABA content

表3 回歸方程的統計分析Table 3 Statistical analysis of regression equation

2.6.3 響應面因素水平的優化 回歸方程各交互項的響應曲面見圖6。

根據回歸方程繪制響應面分析圖，運用Design Expert 8.0軟件對模型進行分析，尋求發芽糙米GABA含量最大值的穩定點及對應的因素水平[14]，由圖6可知，回歸模型存在穩定點，穩定點即極大值點，通過對 回 歸 模 型 求 一 階 偏 導[15]，得 到A、B、C的 編 碼 值 為-0.044、-0.234、-0.028，利用編碼公式Xi=（Xj-X0）/Δj將上述編碼值轉變為實際參數為：單次能量395.55J、閃照次數276.65次、閃照距離11.27cm，此時發芽糙米GABA含量為350.025mg/100g。

2.7 驗證實驗

將上述脈沖強光最佳參數修正為單次能量400J、閃照次數277次、閃照距離11.3cm，重復實驗5次，得發芽糙米GABA含量實測值為345.7mg/100g，與理論值350.025mg/100g接近，可以用此模型預測并指導生產實際。

3 結論

采用Box-Behnken響應面法建立影響因素的二次回歸模型，對數據進行分析，糙米在30℃浸泡12h后，利用脈沖強光閃照處理富集GABA的最佳處理條件為單次能量400J、閃照次數277次、閃照距離11.3cm。擬合實驗誤差小，可為實際預測和評價發芽糙米GABA含量提供理論依據。

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Optimization of pulsed light on the accumulation of GABA conditions in the process of brown rice germination

WANG Bo，MA Tao，HUI Li-juan，LIU He，HE Yu-tang
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Grain and Oil Science and Technology Institute of Bohai University，Jinzhou 121013，China）

The enrichment of GABA during brown rice germination process was promoted by using pulsed light method.Meanwhile，the optimal treatment conditions were optimized by using response surface methodology：single energy of 400J，flash number of 277 and flash distance of 11.3cm.Under the optimized conditions ，the GABA content in germinated brown rice could reach to be 345.7mg/100g.

brown rice；GABA；pulsed light；response surface methodology（RSM）

TS201.1

B

1002-0306（2014）22-0281-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.053

2014－02－28

王勃（1986-），男，碩士研究生，實驗員，研究方向：農產品加工與貯藏。