蝦蛄肉酶法制備抗氧化肽的工藝優(yōu)化和活性研究*

李云濤 陳 博 馬劍茵

(浙江海洋學(xué)院 食品與藥學(xué)學(xué)院 舟山316004)

將蛋白質(zhì)通過(guò)酶解制備成生物活性肽是目前食品、藥品科學(xué)界的研究熱點(diǎn),許多研究資料顯示,多肽有很強(qiáng)的抗氧化活性及抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抑制胰島細(xì)胞凋亡、改善胰島素抵抗、抗高血壓、降血脂、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或分化、抗血管生成等作用(王導(dǎo)等,2011;王靜鳳等,2007),多肽對(duì)許多疾病的發(fā)生、發(fā)展和臨床治療有重要意義。抗氧化肽是一種重要的多肽,它具有清除人體內(nèi)多余自由基,減輕機(jī)體所受損傷,抗衰老、抗腫瘤、解毒等作用(Je等,2005)。國(guó)內(nèi)外的科學(xué)工作者以海洋生物蛋白為原料,通過(guò)酶解法制備抗氧化肽多有報(bào)道,如李志英等(2012)用木瓜蛋白酶水解虎紋海參(Holothuriapervicax),在加酶量12.0%,水解2h,溫度55°C,pH8.0時(shí)得到的酶解液有很好的抗氧化作用。Kim等(2001)用鏈霉蛋白酶E水解阿拉斯加鱈魚(yú)(Theragrachalcogramme)得到的多肽在亞油酸體系中有很高的抗氧化活性,可開(kāi)發(fā)成一種天然的抗氧化劑。Qian等(2008)分別用多種酶水解牛蛙(Ranacatesbeiana)皮蛋白,從中提取并分離純化得到多肽,有很高的抗氧化活性。Binsan等(2008)從白蝦(Litopenaeusvannamei)頭胸部提取出了抗氧化肽等。

蝦蛄(Oratosquillaoratoria)屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、口足目(Stomatopoda)、蝦蛄科(Squillidae)、口蝦蛄屬(Oratosquilla),俗稱“螳螂蝦”、“琵琶蝦”、“蝦爬子”等,產(chǎn)量大,分布廣,絕大多數(shù)種類生活于熱帶和亞熱帶,在中國(guó)南海已發(fā)現(xiàn)80余種。目前對(duì)蝦蛄的藥用研究主要集中在甲殼素和乙醇提取物抗腫瘤方面(顧帝水等,2004;楊丹等,2006),而對(duì)蝦蛄肉酶解多肽的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以蝦蛄肉為原料,用胰蛋白酶酶解制備抗氧化肽。并綜合運(yùn)用正交試驗(yàn)和響應(yīng)面法分析優(yōu)化蝦蛄肉抗氧化肽的酶解條件,既可以讓數(shù)據(jù)點(diǎn)分布均勻合理,又可以分析各項(xiàng)的顯著性和影響因素之間的交互作用,使分析結(jié)果更可靠,更有說(shuō)服性,從而為蝦蛄肉抗氧化肽的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

材料:新鮮蝦蛄采集自浙江舟山近海海域,去殼、頭部、背部,洗凈用勻漿機(jī)攪碎為肉糜。

試劑:胰蛋白酶,鄰二氮菲,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH);其它試劑均為分析純。

儀器設(shè)備:85-2恒溫磁力攪拌器;ZD-420不銹鋼新型電熱恒溫水槽;FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì);BSA323S電子天平;JJ-2組織搗碎機(jī);CF16RXII高速冷凍離心機(jī);FD-1000冷凍干燥機(jī);UV1100紫外分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蝦蛄肉蛋白酶解多肽的制備工藝 精密稱取蝦蛄肉糜,調(diào) pH值,在水浴保溫條件下加入一定量的蛋白酶酶解,酶解到設(shè)定時(shí)間時(shí)將酶解液在100°C水浴中滅活15min,4000r/min離心20min,取上清液冷凍干燥得到蝦蛄肉蛋白酶解物,取定量配制成5mg/ml的水解液樣品,備用。

1.2.2 抗氧化能力的測(cè)定方法 DPPH自由基清除活性的測(cè)定是根據(jù)Bersuder等(1998)描述的方法稍作修改。取 1.5ml樣品與 1.5ml含 0.02%DPPH的99.5%乙醇溶液混合,振蕩,在暗室室溫下放置30min,然后在波長(zhǎng) 517nm處測(cè)吸光值。DPPH自由基清除率(R1)按公式(1)計(jì)算,其中,空白調(diào)零:1.5ml99.5%乙醇+1.5ml蒸餾水,Ac:1.5ml含0.02%DPPH的 99.5%乙醇溶液+1.5ml99.5%乙醇,Aj:1.5ml樣品+1.5ml99.5%乙醇,Ai:1.5ml樣品+1.5ml含0.02%DPPH的99.5%乙醇溶液。

清除羥自由基能力的測(cè)定方法參考Elmastasa等(2006)和金銘等(1996)的工作。取0.75mmol/L的鄰二氮菲 2.0ml于試管中,依次加入 2ml磷酸鹽緩沖液(pH7.4)和2ml蒸餾水,充分混勻后,加入0.75mmol/L的硫酸亞鐵溶液 2ml,混勻,加入 1ml 1.0%的 H2O2,37°C水浴6min,測(cè)定波長(zhǎng)536nm處的吸光度Ap;用1ml蒸餾水代替 1mlH2O2,測(cè)得吸光度Ab;用樣品代替1ml的蒸餾水,測(cè)得吸光度As。羥自由基清除率(R2)按公式(2)計(jì)算。

還原力的測(cè)定參考 Shon等(2004)的方法。2ml酶解液樣品加入到 2ml的 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和2ml的1%鐵氰化鉀溶液的混合液中。混合物50°C水浴20min,在反應(yīng)混合物中加入2ml的10%的 TCA(三氯乙酸),混合后以3000r/min離心10min,取上清 2ml,加入 2ml蒸餾水和 0.4ml的 0.1%FeCl3充分混勻反應(yīng),10min后測(cè)定其在700nm處的吸光值,值越大說(shuō)明還原力越強(qiáng)。

超氧陰離子清除參考許申鴻等(2001)的工作。對(duì)照組:4.5m l50mmol/L的Tris-HCl+4.2ml蒸餾水混勻,于25°C恒溫20min,再加入預(yù)熱過(guò)的 3mmol/L鄰三苯酚 0.3ml,迅速搖勻,立即倒入比色皿中,在波長(zhǎng)325nm處每30s測(cè)定一次吸光度值A(chǔ)0,測(cè)4min,以時(shí)間為橫坐標(biāo),A0為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析,得到的直線斜率為反應(yīng)速率ΔA0。

樣品組:4.5ml 50mmol/LTris-HCl+3.2ml蒸餾水+1ml樣品混勻,于 25°C恒溫 20min,再加入預(yù)熱過(guò)的3mmol/L鄰三苯酚0.3ml,同上操作測(cè)定加樣后的自氧化速率ΔA1。

空白調(diào)零:用9ml 10mmol/L的HCl調(diào)零。

清除超氧陰離子能力用R3表示,由公式(3)計(jì)算得到。

1.2.3 抗氧化肽的組成成分分析方法 水分含量按照 GB/T5009.3-2003測(cè)定,灰分含量按照 GB/T5009.4-2003測(cè)定,采用 BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量,脂肪含量按照GB/T5009.6-2003測(cè)定。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 正交試驗(yàn) 在初步確定酶解工藝的基礎(chǔ)上,選擇料液比(A)、pH值(B)、加酶量(C)、溫度(T)、酶解時(shí)間(D)等因素設(shè)計(jì) L16(45)正交表,優(yōu)化以確定最佳工藝。選取因素和水平排列見(jiàn)表1,正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 因素和水平表Tab.1 Design of factors and levels in the experiments

1.3.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,按照Box-Behnken(操龍飛等,2012)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以pH值、溫度、酶量為自變量,以R1為響應(yīng)值,每一個(gè)自變量的高、中、低水平分別由1、0、–1編碼表示,設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 蝦蛄肉酶解響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.2 Coded variables and their coded levels in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知,5個(gè)因素的極差大小順序?yàn)?B＞T＞A＞C＞D,即 pH 值的影響最大,其次是溫度和料液比,影響最小的是時(shí)間。對(duì)于每一個(gè)因素來(lái)說(shuō),Ti(i=1,2,3,4)是指該因素在表1所示的i水平條件下得到的R1值的均值,根據(jù)極差和均值可得出最優(yōu)組合是︰料液比1︰4,pH 值7.0,加酶量1500u/g,溫度50°C,時(shí)間 2h。

表3 L16(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 L16(45)orthogonal design and results

利用SPSS軟件對(duì)各因素進(jìn)行回歸分析,結(jié)果見(jiàn)表4和表5,采用逐步回歸的方法,模型經(jīng)方差分析檢驗(yàn)得到:F=7.010,P=0.006,在α=0.05水平時(shí),可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果和料液比、pH值和溫度之間存在線性關(guān)系,則回歸方程為Y=26.187–3.503A+2.498B+2.048T。回歸系數(shù)經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)得到三個(gè)因素的P值分別為0.006,0.033,0.072,水平α=0.10時(shí),三個(gè)因素均有顯著性意義。分析結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。由于顯著性因素較多,所以需要通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化,獲得最佳酶解方案。

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Tab.4 ANOVA analysis of orthogonal design results

表5 正交實(shí)驗(yàn)回歸系數(shù)Tab.5 Regression coefficients of orthogonal design

2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

經(jīng)過(guò)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,得到料液比、pH值和溫度是顯著性因素,所以以這三個(gè)因素作為自變量,R1作為響應(yīng)值,具體的因素和水平表見(jiàn)表2,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 蝦蛄肉酶解多肽提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.6 Experimental design and the results of responsesurface analysis

用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表6中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,顯著性檢驗(yàn)和回歸模型系數(shù)見(jiàn)表7。回歸模型的F=23.3,其P=0.0002,表明該模型極為顯著,決定系數(shù)R2=0.9677,表明回歸模型與實(shí)際情況擬合性良好,可以用于酶解工藝。模型中,T、T2對(duì)R1的影響極為顯著,pH對(duì)R1的影響顯著,得到pH值、料液比、溫度的二元回歸模型方程為Y=44.6800+2.10875B+1.23375A+8.11250T–1.21500BA+0.58250BT–0.41250AT–8.33000B2–4.60000A2–6.71750T2。

表7 響應(yīng)面法方差分析(ANOVA)的分析結(jié)果Tab.7 The analysis of variance of the constructed regression model

利用軟件分析各個(gè)因素的交互作用,并根據(jù)回歸分析的結(jié)果繪制相應(yīng)的響應(yīng)面和等高線圖,從圖1—圖3中可以看出各個(gè)因素均有極值點(diǎn),對(duì)二元回歸方程進(jìn)行求導(dǎo),用軟件優(yōu)化分析得到最佳的條件為B=7.070,A=1:3.09,T=51.10°C,R1=47.3466%,經(jīng)驗(yàn)證,在響應(yīng)面所得的最佳條件下得出的R1為49.02 %,與預(yù)測(cè)結(jié)果相比相對(duì)誤差為 3.53%,與預(yù)測(cè)值基本相符,可以作為最佳酶解條件。

圖1 pH和料液比對(duì)R1影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plot for the effect of cross-interaction between pH and S︰L on R1

圖2 pH和溫度對(duì)R1影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot for the effect of cross-interaction between pH and temperature on R1

圖3 料液比和溫度對(duì)R1影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plot for the effect of cross-interaction between S︰L and temperature on R1

2.3 抗氧化肽的組成成分分析

按照 1.2.3中多肽的成分分析方法,測(cè)得蝦蛄酶解多肽中水分、蛋白質(zhì)、脂肪、灰分的含量見(jiàn)表8。

表8 原料成分含量分析Tab.8 Analysis of the ingredient of raw material

2.4 抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以0.1mg/ml維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照,R1為74.10%,R2為 38.64%,R3為 40.01%,還原力為A700為 0.265,樣品超氧陰離子測(cè)定所得數(shù)據(jù)如圖4和圖5所示,ΔA0為0.5646,ΔA1為0.4001,R3為 29.13%,R2為88.9%,還原力A700為0.243。

3 討論與結(jié)論

整個(gè)實(shí)驗(yàn)采用 L16(45)正交試驗(yàn)和三因素三水平的響應(yīng)面分析法(牛瑞等,2011),綜合分析最佳酶解工藝。在正交實(shí)驗(yàn)中存在3個(gè)顯著因素,利用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析方案,響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中建立的模型回歸效果顯著,擬合性良好,可以很好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最終優(yōu)化的最佳酶解條件為︰料液比1︰3.09,pH值7.07,加酶量1500u/g,溫度51.10°C,時(shí)間2h。預(yù)測(cè)R1為47.3466%,經(jīng)驗(yàn)證R1為 49.02%,與預(yù)測(cè)結(jié)果相比相對(duì)誤差為 3.53 %,說(shuō)明該方法可行,這可以為海洋生物提取抗氧化肽提供依據(jù),對(duì)海洋蝦蛄類生物的深加工和開(kāi)發(fā)功能性食品有重要的意義。

圖4 對(duì)照組鄰苯三酚自氧化速率Fig.4 The control group rate of pyrogallol auto-oxidation

圖5 樣品組鄰苯三酚自氧化速率Fig.5 Sample group rate of pyrogallol auto-oxidation

按照最佳條件提取得到的抗氧化肽粗品,經(jīng)抗氧化能力的測(cè)定,得到R2為88.9%,R3為29.13%,還原力A700為 0.243,與維生素 C陽(yáng)性對(duì)照組相比,表明蝦蛄肉酶解多肽的抗氧化性較強(qiáng),可以進(jìn)一步對(duì)粗品進(jìn)行分離純化,利用凝膠滲透色譜、反相高效液相和質(zhì)譜等分析技術(shù)獲得具有較強(qiáng)抗氧化能力的單一多肽。

王 導(dǎo),朱翠鳳,2011.海洋生物活性肽的生理活性研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)綜述,17(5):661—662

王靜鳳,王 奕,崔鳳霞,2007.魷魚(yú)皮膠原蛋白多肽對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成的影響.國(guó)藥理學(xué)通報(bào),23(9):1181—1184

牛 瑞,孫 謐,于建生等,2011.扇貝裙邊酶解制備抗氧化肽的實(shí)驗(yàn)研究.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),18(1):214—221

許申鴻,杭 瑚,李運(yùn)平,2001.超氧化物歧化酶鄰苯三酚測(cè)活法的研究及改進(jìn).化學(xué)通報(bào),8:516—519

李志英,許喜林,陳 健,2012.虎紋海參多肽酶解制備工藝及抗氧化性研究.食品研究與開(kāi)發(fā),33(6):159—161

楊 丹,何蘭珍,劉 毅,2006.從蝦蛄殼制備甲殼素和殼聚糖的研究.食品科學(xué),27(12):437—438

金 鳴,蔡亞欣,李金榮等,1996.鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,23(6):553—555

顧帝水,孔 霞,黃培春,2004.口蝦蛄提取物對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9的抑制作用.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,13(21):2816—2818

操龍飛,游華軍,陳子涵等,2012.響應(yīng)面法優(yōu)化羅非魚(yú)魚(yú)排蛋白分段酶解工藝.海洋與湖沼,43(6):29—32

Bersuder P,Hole M,Smith G,1998.Antioxidants from a heated histidine-glucose model system.Investigation of the antioxidant role of histidine and isolation of antioxidants by high performance liquid chromatography.J Am Oil ChemSoc,75(2):181—187

Binsan W,Benjakul S,Visessanguan Wet al,2008.Antioxidative activity of Mungoong,an extract paste,from the cephalothorax of white shrimp(Litopenaeus vannamei).Food Chem,106(1):185—193

Elmastasa M,Gulcin I,Isildak Oet al,2006.Radical scavenging activity and antioxidant capacity of bay leaf extracts.Journal of the Iranian Chemical Society,3(3):258—266

Je J Y,Park P J,Kim S K,2005.Antioxidant activity of a peptide isolated from Alaska pollack(Theragrachalcogramma)frame protein hydrolysate.Food Res Int,38:45—50

Kim S K,Kim Y T,Byun H Get al,2001.Isolation and characterization of antioxidative peptides from gelatin hydrolysate of Alaska pollack skin.J Agric Food Chem,49(4):1984—1989

Qian Z J,Jung W K,Kim S Ket al,2008.Free radical scavenging activity of a novel antioxidative peptide purified from hydrolysate of bullfrog skin,Rana catesbeiana Shaw.BioresourceTechnol,99(6):1690—1698

Shon M Y,Choi S D,Kahng G Get al,2004.Antimutagenic antioxidant and free radical scavenging activity of ethyl acetate extracts from white,yellow and red onions.Food and Chemical Toxicology,42:659—666