幾種醇對Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解的影響及其工藝條件優化

馬嬌娜，楊國龍*，陳素琴，畢艷蘭，劉 偉

（河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

幾種醇對Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解的影響及其工藝條件優化

馬嬌娜，楊國龍*，陳素琴，畢艷蘭，劉 偉

（河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

研究脂肪酶Lipozyme RM IM催化大豆卵磷脂（phosphatidylcholine，PC）乙醇解反應制備溶血卵磷脂（lysophosphatidylcholine，LPC）過程中其他幾種醇對PC乙醇解的影響，并對乙醇解條件進行了優化。發現正丁醇對PC乙醇解無明顯影響，叔丁醇對PC乙醇解有一定的抑制作用，1,2-丙二醇和丙三醇呈現較好的促進作用。最后選用丙三醇作為乙醇解的促進劑，通過響應面分析法確定了無溶劑體系中Lipozyme RM IM催化PC醇解的最佳工藝條件為加酶量15%（以PC質量計，m/m）、反應溫度28 ℃、加水量8%（水/乙醇溶液，V/V）、丙三醇10% （丙三醇/乙醇溶液，V/V）、底物質量濃度1.49 g/mL（PC/乙醇溶液，m/V）、反應時間11h，此條件下 LPC轉化率高達98.2%。實驗證明，丙三醇對無溶劑體系中Lipozyme RM IM催化條件下的PC乙醇解反應有很好的促進作用。

卵磷脂；Lipozyme RM IM；乙醇解；溶血卵磷脂

由于磷脂親水親油平衡值較低，僅適用于做水/油型乳化劑，限制了其在很多行業中的應用，因此國內外很多學者都致力于磷脂的改性研究。其中，酶法改性因其有優于物理改性和化學改性的諸多特點，是國內外磷脂改性研究的熱點。溶血磷脂的生產，則是磷脂酶法改性技術的重要應用。溶血磷脂在低pH值、高溫、高離子濃度及不同油水比環境下的乳化性和穩定性都遠遠優于普通磷脂，且因其在生理功能、表面活性和抗菌能力等方面的獨特性能，已被廣泛用于醫藥、食品、化妝品和飼料加工等領域[1-2]。

在酶法生產溶血磷脂的研究中，以磷脂酶催化磷脂水解反應居多。本實驗采用來源廣泛、價格便宜的脂肪酶作為工具酶催化卵磷脂醇解制備溶血卵磷脂。目前酶促醇解反應主要用于甘三酯制備生物柴油的研究[3-8]，而磷脂的醇解反應研究較少，因此有必要對其做深入研究。另有報道表明，脂肪酶在不同醇中的反應活性不同，且不同醇的組合會對酯交換反應產生協同作用[9]。因此，本實驗選用醇解法對磷脂進行酶法改性，并研究醇的相互作用對醇解反應的影響，以期尋求最優反應條件，達到提高溶血磷脂產率的目的，為拓展磷脂的應用領域提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆卵磷脂（phosphatidylcholine，PC，純度＞97%） 沈陽天峰生物工程技術有限公司；脂肪酶Lipozyme RM IM 諾維信公司；三氯甲烷、甲醇為色譜純；無水乙醇、正丁醇、叔丁醇、1,2-丙二醇、丙三醇等試劑均為分析純，使用前經分子篩脫水處理。

1.2 儀器與設備

MK-6S棒狀薄層色譜分析儀 日本三菱公司；BSA224S電子天平（最大稱量220 g，感量0.000 1 g）賽多利斯科學儀器有限公司；DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市京華儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶Lipozyme RM IM催化卵磷脂醇解制備溶血卵磷脂

精確稱取一定量的卵磷脂，加入一定體積的醇溶液充分溶解，在恒溫磁力攪拌器中穩定20 min后，加入適量脂肪酶，醇解反應開始，定時取樣進行檢測分析。

1.3.2 PC及其醇解產物的組成分析

采用棒狀薄層色譜-氫火焰離子化檢測器分析PC及其醇解產物中PC、溶血卵磷脂（lysophosphatidylcholine，LPC）、甘油磷脂酰膽堿（glycerylphosphorylcholine，GPC）及其他物質的相對含量（質量分數）。將PC或醇解產物溶解于三氯甲烷中，配制成質量濃度為10～20 mg/mL的溶液，取1 μL溶液點于薄層色譜棒上，在溶劑體系下展開后在90 ℃紅外烘箱中干燥5 min，然后進行檢測分析。展開液為：CHCl3-CH3OH-H2O（42∶22∶2.5，V/V）。檢測條件：氫氣流速100mL/min；空氣流速1.5 L/min；掃描速率30 s/棒。

1.3.3 LPC轉化率計算

式中：w為質量分數。

1.3.4 響應面優化分析

在研究其他醇對PC乙醇解的影響的單因素試驗基礎上，找出促進作用較好的醇，對反應條件進行優化。以LPC轉化率作為響應值，根據響應面法Box-Behnken試驗設計原理，運用Design-Expert 8.0進行響應面優化分析。

2 結果與分析

2.1 無溶劑體系下其他醇對Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解的影響

卵磷脂在乙醇中具有極好的溶解性，乙醇作為反應底物的同時，也可為卵磷脂的醇解提供反應體系。無溶劑體系中進行的酶催化反應，產物容易進一步精制純化。參考前期研究的結果[10]，確定無溶劑體系下酶促卵磷脂乙醇解的反應條件為：加酶量15%（m/m）、反應溫度30 ℃、底物質量濃度2 g/mL（PC/醇溶液，m/V），加水量8%（水/醇溶液，V/V）。在卵磷脂乙醇解最優條件的基礎上，考察無溶劑體系中其他醇對卵磷脂乙醇解的影響。X醇（正丁醇、叔丁醇、1,2-丙二醇和丙三醇）與乙醇的比例為X醇的體積分數，即其占醇溶液總體積的百分比。

2.1.1 正丁醇對PC乙醇解反應的影響

圖1 正丁醇對PC乙醇解中LPC轉化率的影響Fig.1 Effect of n-butanol on the conversion of LPC during ethanolysis of PC

有研究[11-12]使用正丁醇作為油脂醇解底物，進行酯交換反應。本實驗嘗試考察了正丁醇對卵磷脂乙醇解反應的影響，發現添加正丁醇體積分數為10%和20%時，乙醇解過程中LPC轉化率隨時間變化趨勢與不添加正丁醇的乙醇解一致（圖1），反應于16 h達到平衡，LPC轉化率達到92%，正丁醇對卵磷脂乙醇解無影響。Rodrigues等[13]研究無溶劑體系下幾種脂肪酶催化甘三酯與短碳鏈醇的酯交換反應時發現：Lipozyme RM IM在甲醇、乙醇等低分子質量醇中易失活，而在正丁醇中轉化率較高。本實驗結果與之相異可能是由于底物不同所致，卵磷脂的極性比甘三酯大，在乙醇中溶解性很好，從而減弱了乙醇對脂肪酶的失活效果，同時也削弱了正丁醇的促進作用。且正丁醇與乙醇都為直鏈結構，雖然其碳鏈長度較乙醇略有增長，但在最適宜乙醇解條件下其分子動能與傳質能力并未受到因分子體積增大帶來的抑制作用，底物分子間的結合機率未受到影響，故正丁醇與乙醇間未表現出明顯的相互作用。

2.1.2 叔丁醇對PC乙醇解反應的影響

隨著醇溶液中叔丁醇比例的增加，醇解反應速率逐漸降低，對反應呈現抑制作用（圖2）。近年來，叔丁醇在酶促油脂酯交換制備生物柴油的研究中備受重視[14-15]。由于甲醇、乙醇等短碳鏈醇在油脂中的溶解性不好而易使酶失活[16]，且甘三酯的醇解反應產物——甘油對酶有毒害作用[17]。叔丁醇因其對甘油的溶解性較好，有助于酶的激活并使固定化脂肪酶穩定性增強，還可用作酶的前處理及再利用時的清洗，而被用作酶促酯交換的反應介質[18-20]。本研究中叔丁醇對卵磷脂乙醇解呈現抑制作用，與甘三酯醇解中叔丁醇所表現出的積極作用相反，可能是因為底物的不同，卵磷脂比甘三酯極性大，對乙醇的溶解性好，且反應過程中無甘油產生，叔丁醇對甘三酯醇解的促進作用在此無法體現。而且，由于叔丁醇的空間結構使得羥基受到位阻的影響，叔丁醇羥基與卵磷脂分子的碰撞機率減少，底物與酶的結合也受到影響。叔丁醇對卵磷脂乙醇解表現出抑制作用。

圖2 叔丁醇對PC乙醇解中LPC轉化率的影響Fig.2 Effect of t-butanol on the conversion of LPC during ethanolysis of PC

2.1.3 1,2-丙二醇對PC乙醇解反應的影響

圖3 1,2-丙二醇對PC乙醇解中LPC轉化率的影響Fig.3 Effect of 1,2-propanediol on the conversion of LPC during ethanolysis of PC

向乙醇溶液中添加體積分數為10%和15%的1,2-丙二醇后，醇解反應速率逐步增加，達到反應平衡所用時間縮短，且產品得率有所提升（圖3）。添加20%的丙二醇的醇解反應趨勢與15%時差別不大，反應于12h接近平衡，LPC轉化率達95%。1,2-丙二醇對卵磷脂乙醇解反應表現出較好的促進作用，可能是因為丙二醇作為二元醇，與卵磷脂都是極性物質，且其極性比乙醇大，對體系中微量水有很好的溶解性和分散性，可能會有效調節水與酶的接觸[21]。

2.1.4 丙三醇對PC乙醇解反應的影響

圖4 丙三醇對PC乙醇解中LPC轉化率的影響Fig.4 Effect of glycerol on the conversion of LPC during ethanolysis of PC

向反應體系中加入體積分數為5%和10%的丙三醇后，醇解反應速率明顯提升，產品得率顯著增加；反應于10h達到平衡，LPC轉化率達96%（圖4）。許多報道研究[22-26]指出脂肪酶催化甘三酯制備生物柴油時，甘油在油中難溶，易吸附于固定化酶表面而對酶的活性及穩定性產生影響。本實驗中丙三醇不僅未表現出抑制作用反而有促進作用，是因為丙三醇能夠較好地分散于卵磷脂、乙醇和溶血卵磷脂組成的混合體系中，丙三醇很難與固定化脂肪酶發生強的相互作用從而堵塞固定化酶的多孔性通道。丙三醇也可能會使微量水分保留在脂肪酶周圍，有助于激活并穩定固定化脂肪酶[27]。加入20%的丙三醇后，反應速率有所提升，但產品最終得率與加入10%丙三醇時一致，因加入過多的丙三醇，底物已經達到飽和，且其極性對酶有不利影響，丙三醇對反應的促進作用保持穩定。總之，無溶劑體系下丙三醇對Lipozyme RM IM催化的卵磷脂乙醇解有顯著的促進作用。

2.2 響應面優化分析

通過對無溶劑體系下其他醇對Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解影響的考察，發現1,2-丙二醇和丙三醇對卵磷脂的乙醇解反應有促進作用。綜合考慮兩者的價格及所需添加比例，選擇丙三醇體積分數為10%的乙醇溶液進行響應面優化試驗。

表1 Lipozyme RM IM催化醇解反應試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in the experimental design for Lipozyme RM IM catalyzed ethanolysis of PC

以LPC轉化率為響應值，選取對其影響較大的3 個因素變量做三因素三水平響應面試驗。固定其他反應條件為：加酶量15%（m/m）、加水量為醇溶液總體積的8%、丙三醇占醇溶液總體積10%。試驗因素水平見表1，響應面試驗設計及結果見表2。

各因素經二次多項回歸擬合后，得到回歸方程：LPC轉化率=95.91-1.76A-0.61B+15.48C+17.49AB-4.48AC+1.68BC-10.63A2-10.93B2-7.99C2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results

從表3可知，回歸方程極顯著。相關系數R2=0.984 2，說明響應值的變化有98.42%來源于所選變量，即反應溫度、底物質量濃度和反應時間。因此，回歸方程可較好地描述各因素與響應值之間的關系。當P值小于0.05時，表示該因素對響應值變化的影響是顯著的。由方差分析表可知，因素C、AB、AC、B2、C2是顯著的，表明各試驗因素對響應值變化的影響并不是簡單的線性關系。

表3 LPC轉化率模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model describing LPC conversion

圖5～7可直觀反應各因素間的交互作用對LPC轉化率的影響。通過比較可以發現，反應時間和底物質量濃度的交互作用影響不顯著，反應溫度和反應時間、反應溫度和底物質量濃度的交互作用影響顯著。

圖5 反應溫度和底物質量濃度交互作用對LPC轉化率的影響Fig.5 Interaction between temperature and substrate concentration on LPC conversion

圖6 反應溫度和反應時間交互作用對LPC轉化率的影響Fig.6 Interaction between reaction temperature and time on LPC conversion

圖7 反應時間和底物質量濃度交互作用對LPC轉化率的影響Fig.7 Interaction between reaction time and substrate concentration on LPC conversion

以LPC轉化率最大化為目標，運用回歸模型分析得到最佳反應條件為：反應溫度27.92 ℃、底物質量濃度1.49 g/mL、反應時間10.99 h。在此條件下LPC轉化率理論值為98.6%。考慮到實際操作的可能性，將工藝條件確定為：反應溫度28 ℃、底物質量濃度1.49 g/mL、反應時間11 h。按此條件進行平行驗證實驗，得LPC轉化率平均值為98.2%，與理論值相差不大。因此，基于響應面分析法得到的優化工藝條件可靠，有一定的實際應用價值。

3 結 論

無溶劑體系下Lipozyme RM IM催化PC乙醇解的過程中，正丁醇對PC乙醇解無明顯影響，叔丁醇對PC乙醇解有一定的抑制作用，1,2-丙二醇和丙三醇呈現較好的促進作用。最后選用丙三醇與乙醇進行協同作用，通過響應面優化試驗確定了無溶劑體系中Lipozyme RM IM催化PC醇解的最佳工藝條件為加酶量15%（m/m）、反應溫度28℃、加水量8%（水/醇溶液，V/V）、丙三醇10%（丙三醇/醇溶液，V/V）、底物質量濃度1.49 g/mL（PC/醇溶液，m/V）、反應時間11 h，此條件下LPC轉化率為98.2%。實驗證明，利用丙三醇可以使Lipozyme RM IM催化的卵磷脂乙醇解反應速率明顯提升，且產品得率得以顯著增加，可為溶血磷脂的生產提供一定參考，但其產生協同作用的具體機理還有待深入研究。

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Effect of Other Alcohols on Lipozyme RM IM-Catalyzed Ethanolysis of Phosphatidylcholine and Optimization of the Ethanolysis Process

MA Jiao-na, YANG Guo-long*, CHEN Su-qin, BI Yan-lan, LIU Wei
(School of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)

The effects of other alcohols on the Lipozyme RM IM-catalyzed ethanolysis of soy phosphatidylcholine (PC) for the preparation of lysophosphatidylcholine (LPC) were studied and the ethanolysis conditions were optimized. The results showed that n-butanol had no significant synergistic or inhibitory effect on the ethanolysis of PC, while tert-butanol displayed an inhibitory effect, and 1,2-propylene glycol and glycerol exhibited a significant synergistic effect. Glycerol was chosen as the synergistic agent for PC ethanolysis. The optimal conditions for the ethanolysis catalyzed by Lipozyme RM IM in solvent-free system were obtained by response surface methodology as follows: lipase dosage, 15% (based on the mass of PC); temperature, 28 ℃; ratio of water to ethanol solution, 8% (V/V); ratio of glycerol to ethanol solution, 10% (V/V); substrate concentration, 1.49 g/mL (PC/ethanol solution ratio, m/V), and reaction time, 11 h. Under these conditions, the conversion rate of LPC was 98.2%. Glycerol exhibited a significant synergistic effect on the ethanolysis of PC.

phosphatidylcholine; Lipozyme RM IM; ethanolysis; lysophosphatidylcholine

TS201.2

A

1002-6630（2014）22-0092-05

10.7506/spkx1002-6630-201422017

2014-04-08

河南省高等學校青年骨干教師資助計劃項目（2011GGJS-079）；河南工業大學研究生教育創新計劃項目（2012YJCX10）

馬嬌娜（1988—），女，碩士研究生，研究方向為脂質生物改性。E-mail：13592547284@163.com

*通信作者：楊國龍（1974—），男，副教授，博士，研究方向為脂質化學與生物技術。E-mail：ygl88888@haut.edu.cn