食品過敏原澳洲堅果環介導等溫擴增檢測方法的建立與應用

劉 津，張 雋，李 婷，張 璜，高東微，李志勇,*

（1.廣東檢驗檢疫技術中心，廣東 廣州 510623；2.廣州迪澳生物科技有限公司，廣東 廣州 510663）

食品過敏原澳洲堅果環介導等溫擴增檢測方法的建立與應用

劉 津1，張 雋1，李 婷1，張 璜2，高東微1，李志勇1,*

（1.廣東檢驗檢疫技術中心，廣東 廣州 510623；2.廣州迪澳生物科技有限公司，廣東 廣州 510663）

根據澳洲堅果豌豆蛋白AMP2基因序列，利用設計軟件Primer Explorer Version 4設計并篩選了食品過敏原澳洲堅果的環介導等溫擴增引物，對反應體系和反應條件進行優化，建立澳洲堅果的環介導等溫擴增檢測方法，結果判斷可采用實時熒光法和熒光染料終點顯色法。對該方法進行了特異性、靈敏度、穩定性評價，結果顯示：該方法能夠特異性、靈敏、穩定地檢測食品中的澳洲堅果成分，檢測低限為0.5%。此外，對7 種市售食品樣品的檢測結果表明，該方法與食品標簽標示的過敏原成分結果吻合率為100%，假陽性率和假陰性率均為0，在市售食品的過敏原成分檢測上較商業化快速檢測試紙條更加穩定可靠。

食品過敏原；澳洲堅果；環介導等溫擴增；檢測方法

澳洲堅果（Macadamia ternifolia），又名夏威夷果、澳洲胡桃、昆士蘭栗，為山龍眼科澳洲堅果屬植物。澳洲堅果果仁，呈奶白色，營養豐富，除了用于制作干果外，還可制作糕點、巧克力等[1-2]。澳洲堅果引起的過敏癥狀包括嘴唇、眼睛、喉嚨充血紅腫、蕁麻疹、結膜炎和呼吸困難等[3]，是食品過敏原標識管理的重要種類。國際食品法典委員會制定的國際標準CODEX STAN 1-1985《預包裝食品標簽通則》明確規定了澳洲堅果及其產品必須在預包裝食品標簽上予以標識[4]。在國際標準的基礎上，世界各國紛紛頒布了各自的法規標準，對澳洲堅果這種過敏原成分的標識管理進行了詳細的規定[5-6]。我國在各級食品標準中也做出了相關規定，例如GB 7718—2011《預包裝食品標簽通則》、GB/T 23779—2009《預包裝食品中的致敏原成分》等均對此有明確的規定[7-8]。

食品過敏原標識管理的有效實施，依賴于完善的監控技術手段。其中，食品過敏原檢測技術是必不可少的一個組成部分。特別是進出口食品檢驗方面，我國主要貿易國家對過敏原標識管理的日趨嚴格，對檢測技術提出了迫切的現實需求。但是，目前為止國內外尚未發布澳洲堅果過敏原成分的標準檢測方法，澳洲堅果過敏原檢測技術研究的文獻也鮮有報道，國外對澳洲堅果的檢測通常采用一種商業化過敏原蛋白質免疫層析快速檢測技術，國內對澳洲堅果尚未建立任何達到行業應用水平的通用方法。這種現狀已經嚴重影響了過敏原標識管理相關法規標準的科學有效實施。因此，在預包裝食品過敏原檢驗技術領域，目前急需制定更加普適、簡便、準確、成本低廉的澳洲堅果過敏原檢測方法，使之適用于食品企業品質安全檢驗和進出口食品實驗室檢驗。

目前食品過敏原檢測的方法主要分為兩大類，一類是基于蛋白質檢測的方法，一類是基于基因檢測的方法。然而，現有研究結果表明食品過敏原中能夠引起過敏反應的蛋白質組成復雜，澳洲堅果中存在的過敏原蛋白質組成尚未完全調查清楚，因此以某種過敏原蛋白質為檢測目標物質建立的蛋白質檢測技術得到的檢測結果存在與實際致敏效應發生偏差的可能性；基于免疫學原理的蛋白質檢測技術對檢測樣品提取物的背景干擾具有較高的要求，與此同時由于預包裝食品種類、配料成分、加工工藝千差萬別造成背景干擾非常復雜，極大局限了澳洲堅果過敏原蛋白質免疫檢測方法的實際應用效果[9]。此外，相對于核酸而言，澳洲堅果過敏原蛋白質容易在食品加工過程中發生變性，對基于免疫學原理的蛋白質檢測技術造成不可忽略的性能下降。相比之下，基于基因檢測的方法以食品過敏原的特異性基因片段為檢測對象，通過食品中是否存在過敏原所屬物種的保守基因片段判斷是否含有某種特定的過敏原成分。由于核酸的穩定程度比蛋白質高，在食品加工過程中不易被破壞，因此這類技術可以更加穩定地檢測出微量的過敏原成分[10]。

現有常用的基因檢測方法包括聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）和環介導等溫擴增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），但是PCR技術需要使用大型的儀器設備、耗時長、對技術要求高、成本昂貴，并不適用于基層實驗室的推廣應用。環介導等溫擴增法是2000年由Notomi等發明的一種恒溫核酸擴增方法[11]。LAMP技術發展至今，既可采用熒光染料終點顯色法，利用SYBR GREEN Ⅰ等熒光染料可嵌合到擴增產物中，發生顯著的顏色變化，可用肉眼進行顏色判斷；又可采用實時熒光LAMP法，通過使用高精度的實時熒光儀對LAMP反應的過程進行實時監控[12-14]。目前，LAMP技術已經在食品安全、公共衛生安全監測和應急檢測、臨床醫學診斷、生物安全、生物識別等專業技術領域獲得了廣泛的應用[15-18]。本實驗以澳洲堅果AMP2豌豆球蛋白基因為目的基因，建立能夠特異、靈敏、穩定地檢測食品中的澳洲堅果成分的LAMP檢測方法，并且能夠同時用實時熒光法和熒光染料終點顯色法進行判斷，既能應用于大中型實驗室，又能應用于基層快速大規模篩查。

1 材料與方法

1.1 樣品種類及來源

澳洲堅果（Macadamia ternifolia）、巴西堅果（Bertholletia excelsa）、開心果（Pistacia vera）、核桃（Juglans regia）、碧根果（Carya illinoensis (Wangh.) koch）、腰果（Anacardium occidentalie）、松籽（Pinus koraiensis）、榛子（Corylus avellana）、美國大杏仁（Amygdalus communis）、葵花籽（Helianthus annuus）、板栗（Castanea mollissima）、苦杏仁（Semen Armeniacae Amarum）、南瓜籽（Cucurbita moschata）、蓮子（Semen Nelumbinis）和大米（Oryza sativa） 市購。

1.2 試劑與儀器

Promega Wizard?基因組DNA純化試劑盒 北京盈田卓越科技有限公司；Ex Taq和dNTPs購自寶生物工程（大連）有限公司；甜菜堿、Bst DNA聚合酶和10× ThermoPol緩沖液 德國Sigma公司；1 000× SYBR GreenⅠ 廈門致善生物科技有限公司；SYTO-9 美國Invitrogen公司；LAMP引物由上海生工生物工程有限公司合成；r-biopharm?澳洲堅果快速檢測試紙條（BL 605） 拜發分析系統銷售（北京）有限公司。

1000核酸蛋白分析儀 美國Nanodrop科技有限公司；ABI 7500實時熒光定量PCR儀 美國應用生物系統公司；恒溫金屬浴 杭州奧盛儀器有限公司；GelDoc XR+凝膠成像系統 美國伯樂生命醫學產品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA模板的提取和純化

根據GB/T 19495.3—2004《轉基因產品檢測：核酸提取純化方法》規定[19]，采用標準方法從供試材料中提取植物基因組DNA，用核酸蛋白分析儀測定DNA的濃度和純度，將DNA溶液稀釋至100 ng/μL，-20 ℃保存備用。對提取出的植物基因組DNA用植物通用引物Plant 159進行檢測[20]，檢測結果陽性表明提取出適宜進行擴增的DNA，否則應重新進行DNA提取和純化。

1.3.2 引物的設計與篩選

根據GenBank數據庫中澳洲堅果AMP2豌豆球蛋白基因（Macadamia integrifolia vicilin precursor (AMP2)，Accession no. AF161883.1）序列，通過BLAST在線比對軟件進行分析，在澳洲堅果序列的種特異性區域，利用LAMP引物在線設計軟件Primer Explorer Version 4分別設計包括兩條外引物F3、B3、兩條內引物FIP、BIP的LAMP引物各3 套，由上海生工生物工程有限公司合成。根據引物的擴增效果選取最佳的引物后，使用Primer Explorer Version 4設計環引物。在LAMP反應的循環延伸階段，所有的莖環DNA與內引物或環引物結合，引導鏈置換延伸反應，可加快反應速度，縮短近一半的反應時間，提高檢測效率。

1.3.3 LAMP反應體系的建立

根據文獻[11]，初步確定25 μL的LAMP反應體系：內引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，外引物F3和B3各0.2 μmol/L，環引物LF和LB各0.8 μmol/L，1×ThermoPol緩沖液，1mol/L甜菜堿，6 mmol/L MgSO4，1.6 mmol/L dNTP，0.32 U/μL Bst DNA聚合酶，DNA模板200 ng。將LAMP反應體系配制完成后置于0.2 mL離心管中，在離心管中加入1 滴石蠟油以避免反應體系揮發和污染。

LAMP反應可采用兩種結果判讀方法，一是熒光染料顯色法，二是實時熒光法。

熒光染料顯色法是在上述管蓋內壁加入1 μL 1 000×SYBR GreenⅠ。蓋管蓋時應小心，防止顯色液混合進入反應液中。然后將其置于金屬浴在63 ℃恒溫反應90 min，最后80 ℃滅活5 min結束反應。反應結束后，將離心管上下顛倒混勻或離心，使蓋內壁的SYBR GreenⅠ與反應液混合，觀察離心管中反應液顏色。如發生特異性擴增，溶液變為綠色，否則保持SYBR GreenⅠ橙色不變。

實時熒光法是在反應體系中加入0.2 ?mol/L SYTO-9，通過實時熒光PCR儀設定Holding Stage為63℃、30 s，1 個循環；Cycling Stage為63 ℃、15 s，63 ℃、45 s，90個循環，于63℃、45 s處收集熒光信號，熒光通道為FAM。

1.3.4 LAMP引物的篩選

用澳洲堅果DNA作為模板，用大米DNA作為陰性對照，每組對照分別設置2 個平行，通過實時熒光法檢測LAMP反應。通過觀察實時熒光的擴增曲線，根據起始擴增時間、擴增曲線的重復性等指標對引物進行篩選。

1.3.5 LAMP反應體系和反應條件的優化

根據文獻[11]報道，反應溫度、反應時間、鎂離子濃度、甜菜堿濃度和dNTPs濃度是影響LAMP擴增效果的重要因素。由于Bst DNA聚合酶最適溫度在61～65 ℃，本實驗選取61、62、63、64 ℃和65 ℃ 5個溫度條件進行LAMP反應，通過實時熒光法檢測LAMP反應，選取適宜的溫度。在適宜的溫度條件下，依次對Mg2+、甜菜堿和dNTPs濃度和反應時間進行優化，其中Mg2+選取2、4、6、8、10 mmol/L 5 個濃度梯度，甜菜堿選取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L 5 個濃度梯度，dNTPs選取0.8、1.2、 1.6、2.0、2.4 mmol/L 5 個濃度梯度。通過實時熒光法檢測LAMP反應，確定最佳反應體系和反應條件。

1.3.6 特異性實驗

高度特異性是過敏原檢測方法必須具備的基本特性，為此利用建立的LAMP方法對澳洲堅果、腰果、花生、巴西堅果、碧根果、杏仁、開心果、葵瓜子、板栗、榛子、核桃、南杏、北杏、松子、南瓜子、西瓜子、蓮子共17 種常見的堅果進行LAMP擴增，同時采用顯色法和實時熒光法進行檢測。

1.3.7 靈敏度實驗

為確定本方法的相對靈敏度，用100 ng/μL的大米DNA為基質，用100 ng/μL的澳洲堅果DNA按照體積比制成不同梯度濃度（0%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%）的澳洲堅果模擬樣品DNA，用不同濃度梯度的模擬樣品DNA進行LAMP擴增，每個梯度濃度設置2 個平行，用實時熒光法和顯色法同時進行靈敏度測試。

1.3.8 穩定性實驗

為評估本方法的穩定性，對0.5%、1%、5%的澳洲堅果模擬樣品DNA進行LAMP擴增，每個濃度分別采用實時熒光法和顯色法重復10 次，同時以0%的澳洲堅果模擬樣品DNA作為陰性對照，用以測試本方法的穩定性。

1.3.9 適用性實驗

利用建立的LAMP方法對共計7 份進口商品和市售商品進行檢測，同時采用商業化快速檢測試紙條進行檢測，兩種方法進行對比。

2 結果與分析

2.1 LAMP引物篩選

本研究針對澳洲堅果AMP2豌豆球蛋白基因設計了3 套LAMP檢測引物，通過LAMP反應實時熒光法結果顯示，第1套引物出現對數擴增時間分別為70 min和80 min，第2套引物出現對數擴增時間約為35 min，兩個平行重復性較好，3 套引物出現對數擴增時間約為40 min。因此，選取第2套引物進行下一步的實驗，為了增加擴增效率，引入環引物一對，最佳引物序列見表1。

表1 澳洲堅果LAMP擴增引物序列Table 1 The primers for LAMP assay of macadamia nut

2.2 LAMP反應體系和反應條件的優化

2.2.1 反應溫度的優化

以澳洲堅果DNA為模板，利用設計的引物在不同溫度條件進行LAMP反應，實時熒光法檢測LAMP反應的結果見圖1。由圖1可知，當反應溫度為63 ℃時出現指數擴增的時間最早，因此選取63 ℃為最佳反應溫度。

圖1 不同反應溫度澳洲堅果LAMP檢測結果圖（實時熒光法）Fig.1 RT-LAMP detection of macadamia nut at different reaction temperatures

2.2.2 反應體系的優化

以澳洲堅果DNA為模板，在反應溫度為63 ℃的條件下，依次對Mg2+、甜菜堿和dNTPs濃度進行優化，結果見圖2～4。

圖2 不同鎂離子濃度澳洲堅果LAMP檢測結果圖（實時熒光法）Fig.2 RT-LAMP detection of macadamia nut with different Mg2＋concentrations

圖3 不同甜菜堿濃度澳洲堅果LAMP檢測結果圖（實時熒光法）Fig.3 RT-LAMP detection of macadamia nut with different betaine concentrations

選取最早出現指數擴增曲線的反應體系濃度為最佳濃度，由圖2～4可知，在25 μL反應體系中，當Mg2+濃度為6 mmol/L、甜菜堿濃度為0.8 mol/L、dNTPs濃度為1.6 mmol/L，在63 ℃反應45 min，LAMP反應擴增效果最好。

圖4 不同dNTPs濃度澳洲堅果LAMP檢測結果圖（實時熒光法）Fig.4 RT-LAMP detection of macadamia nut with different concentrations of dNTPs

2.3 特異性實驗

利用建立的LAMP方法對澳洲堅果及其他16 種堅果進行特異性擴增。實時熒光法和顯色法的實驗結果分別見圖5和圖6。

圖5 澳洲堅果LAMP檢測方法特異性實驗結果（實時熒光法）Fig.5 Specificity of the RT-LAMP assay for macadamia nut

圖6 澳洲堅果LAMP檢測方法特異性實驗結果（熒光染料顯色法）Fig.6 Specificity of the LAMP assay using fluorescent dye for macadamia nut

由圖5可知，澳洲堅果LAMP檢測實時熒光法僅澳洲堅果出現特異性擴增，其他堅果均未出現擴增；澳洲堅果LAMP檢測熒光染料顯色法僅以澳洲堅果DNA為模板的反應管，在反應結束后加入SYBR Green Ⅰ熒光染料顯色為綠色，以其他堅果DNA為模板的反應管均顯示為黃色，且2 個平行管中的反應無差異。結果表明，本實驗建立的LAMP方法對澳洲堅果具有高度的特異性。

2.4 靈敏度實驗

實時熒光法和熒光染料顯色法的實驗結果分別見圖7和圖8，可知LAMP實時熒光法和熒光染料顯色法均可檢出100%、10%、5%、1%、0.5%的澳洲堅果陽性樣品，不能檢出0.1%和0.05%的陽性樣品。LAMP實時熒光法的檢測結果顯示巴西堅果濃度越高，開始出現指數擴增的時間越短，Ct值越小。靈敏度實驗結果表明，本標準檢測方法對澳洲堅果的最低檢測限可達0.5%。

圖7 澳洲堅果LAMP檢測方法靈敏度實驗結果（實時熒光法）Fig.7 Sensitivity of the RT-LAMP assay for macadamia nut

圖8 澳洲堅果LAMP檢測方法靈敏度實驗結果（顯色法）Fig.8 Sensitivity of the LAMP assay using fluorescent dye for macadamia nut detection method

2.5 穩定性實驗

表2顯示：澳洲堅果LAMP檢測方法對0%、0.5%、1%和5%的澳洲堅果樣品進行10 次重復檢測，在不同濃度和各次重復中均能得到準確穩定的檢測結果，假陽性率和假陰性率均為0，表明本方法具有良好的穩定性和重復性。注：+.陽性；—.陰性。

表2 澳洲堅果LAMP檢測方法穩定性實驗結果Table 2 Stability of the LAMP assay for macadamia nut

2.6 適用性實驗

實際樣品的檢測結果見表3、圖9～11。

表3 澳洲堅果LAMP檢測方法適用性實驗結果Table 3 Applicability of the LAMP assay for macadamia nut

圖9 澳洲堅果LAMP檢測方法適用性實驗結果（實時熒光法）Fig.9 Applicability of the RT-LAMP assay for macadamia nut

圖10 澳洲堅果LAMP檢測方法適用性實驗結果（顯色法）Fig.10 Applicability of the LAMP assay using fluorescent dye for macadamia nut

圖11 澳洲堅果快速檢測試紙條適用性實驗結果Fig.11 Applicability of rapid test strips for macadamia nut

澳洲堅果LAMP檢測實時熒光法和熒光染料顯色法的檢測結果與配料表中所標識的澳洲堅果是否存在的實際情況完全一致，假陽性率和假陰性率均為0。快速檢測試紙條在檢測樣品1和2時均出現了弱陽性，檢測結果較難判斷。相比而言，本實驗建立的澳洲堅果LAMP檢測方法在檢測樣品1和2時，實時熒光法顯示樣品1和2出現了指數擴增，熒光染料顯色法顯示樣品1和2均為陽性，且2個平行管結果一致，陽性結果易于判斷。

適用性實驗結果表明，本實驗建立的澳洲堅果LAMP檢測方法可用于預包裝食品中澳洲堅果的檢測，在檢測市售食品樣品時，特別是食品中含有低濃度澳洲堅果成分時，性能較商業化快速檢測試紙條更佳。

3 討 論

本實驗建立的澳洲堅果LAMP檢測方法該方法能夠特異、靈敏、穩定地檢測食品中的澳洲堅果成分，檢測低限為0.5%，可采用實時熒光法和熒光染料終點顯色法兩種方法進行檢測。實時熒光法的優點在于可通過使用高精度的實時熒光儀對LAMP反應的過程進行實時監控，尤其是在方法建立時優勢突出，例如在引物篩選、反應條件和反應體系優化時，可以通過擴增曲線直觀的分辨出指數擴增出現的時間遲早和效率高低，從而進行引物篩選和反應優化，大大提高了LAMP技術的靈敏性和準確性；實時熒光法的缺點在于需要使用大型的儀器設備，對實驗室硬件配置要求較高。熒光染料終點顯色法的特點在于利用SYBR GREEN Ⅰ等熒光染料可嵌合到擴增產物中，發生顯著的顏色變化，突出的優點是通過反應終點的顏色變化進行結果判斷，無需使用大型的儀器設備，可在基層實驗室推廣使用，也可用于現場檢測；缺點是高濃度的熒光染料對LAMP反應具有抑制作用，因此擴增-檢測需要分步進行，實驗操作上與實時熒光法相比需要額外在擴增反應結束時加入熒光染料，稍顯不便。本實驗建立的澳洲LAMP檢測方法可采用上述兩種方法進行檢測，兩種方法互為補充，可有效地對食品中澳洲堅果過敏原成分進行檢測和監控，能夠極大的滿足業務需要。

經文獻調研，國內外均未發布澳洲堅果過敏原成分的標準檢測方法，關于澳洲堅果過敏原成分檢測技術也鮮有報道，國外對澳洲堅果的檢測通常采用一種商業化過敏原蛋白質免疫層析檢測試紙條，因此，在適用性實驗部分將本實驗建立的澳洲堅果LAMP檢測方法與該方法進行了性能比較，結果顯示本實驗建立的方法性能較佳。原因可能有3 個方面：第1，由于食品樣品中澳洲堅果含量低且分布不均勻影響了檢測結果；第2，檢測對象不同影響實驗結果，LAMP技術的檢測對象是核酸，而蛋白質免疫層析檢測試紙條的檢測對象為蛋白質，由于在加工過程中澳洲堅果核酸的穩定程度比蛋白質高，因此本實驗建立的方法可以更加穩定的檢測出微量的過敏原成分；第3，商業化過敏原蛋白質免疫層析檢測試紙條對檢測樣品提取物的背景干擾具有較高的要求，由于食品類別、配料、加工工藝不同造成背景干擾非常復雜，對免疫檢測方法的檢測效果造成了負面影響。此外，澳洲堅果免疫層析檢測試紙條為國外商業化試劑產品，價格昂貴，且訂貨期長，相比而言，本實驗建立的澳洲堅果LAMP檢測方法只需合成引物和配制試劑即可建立檢測方法，檢測試劑成本低廉，且無需昂貴的儀器設備，更加適合基層實驗室推廣應用。

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Construction and Application of Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Detection of Macadamia Nut as a Food Allergen

LIU Jin1, ZHANG Jun1, LI Ting1, ZHANG Huang2, GAO Dong-wei1, LI Zhi-yong1,*
(1. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangzhou 510623, China; 2. Guangzhou Di Ao Bio-Technology Co. Ltd., Guangzhou 510663, China)

According to the Macadamia integrifolia vicilin precursor AMP2 gene sequences, sets of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primers were designed and screened using the design software Primer Explorer Version 4, then the relevant LAMP method was established for the detection of macadamia nuts as a food allergen by measuring the results using real-time fluorescence or using a fluorescent dye in the reaction end. An evaluation of this method indicated the satisfied specificity, sensitivity and stability in the identification of macadamia nuts from foods with a LOD of 0.5%. In addition, the detection of 7 marketed food samples using this method showed 100% consistency with the labeled information of allergen ingredients with zero false positive and negative rates, and thus, proved its better performances than commercial rapid test strips.

food allergen; macadamia nut; loop-mediated isothermal amplification (LAMP); detection method

TS255.6

A

1002-6630（2014）22-0226-07

10.7506/spkx1002-6630-201422044

2013-11-17

出入境檢驗檢疫行業標準制定計劃項目（2012B141）

劉津（1983—），女，工程師，碩士，研究方向為食品分子生物學檢測。E-mail：ivfhonline@126.com

*通信作者：李志勇（1972—），男，研究員，博士，研究方向為食品安全和檢測。E-mail：lizy@iqtc.cn