環介導等溫擴增技術檢測食品中酸土環脂芽孢桿菌

周贊虎，張海艷，鄭俊超，江喆敏，陳春香，何藝貞，林俊君，蘇雪勤，王根芳，鄭天凌*

（1.廈門大學生命科學學院，濱海濕地生態系統教育部重點實驗室，福建 廈門 361005；2.漳州出入境檢驗檢疫局，福建 漳州 363000；3.漳州衛生職業學院，福建 漳州 363000）

環介導等溫擴增技術檢測食品中酸土環脂芽孢桿菌

周贊虎1,2，張海艷3，鄭俊超2，江喆敏2，陳春香2，何藝貞2，林俊君2，蘇雪勤2，王根芳2，鄭天凌1,*

（1.廈門大學生命科學學院，濱海濕地生態系統教育部重點實驗室，福建 廈門 361005；2.漳州出入境檢驗檢疫局，福建 漳州 363000；3.漳州衛生職業學院，福建 漳州 363000）

目的：利用環介導等溫擴增技術建立食品中酸土環脂芽孢桿菌快速檢測方法。方法：針對酸土環脂芽孢桿菌16S序列設計特異引物，再優選反應體系，用顯色法檢測實驗結果。結果：該方法能夠在63 ℃條件下1 h內檢出食品中酸土環脂芽孢桿菌，所設計的引物有良好的特異性；靈敏度達6.7 CFU/mL（弱陽性）。結論：該方法具有高效、特異性強和敏感性高等特點，可滿足酸土環脂芽孢桿菌快速檢測篩選的要求。

環介導等溫擴增；酸土環脂芽孢桿菌；食品

酸土環脂芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）[1]是一種嗜熱、嗜酸、好氧的桿菌，是耐熱菌（thermoacidophilic bacteria，TAB）中污染果汁的主要菌種，其芽孢能經受酸性果汁加工中的巴氏殺菌而存活，在適宜的溫度條件下可大量繁殖，可以引起巴氏滅菌果汁的腐敗，產生難以接受的氣味，在這種腐敗初期，產品并不出現明顯的漲包或酸敗，但該菌代謝產物在極低濃度就會使果汁口感風味變劣，產生濁度升高乃至形成白色沉淀等質量危害。耐熱菌超標是濃縮果汁產品最為嚴重的質量問題之一。近年來，我國濃縮蘋果汁行業取得了突飛猛進的進步，2010年我國已經成為世界蘋果濃縮汁的生產出口第一大國。2013年1—12月我國出口濃縮蘋果汁數量為59.79萬 t，金額為8.98億 美元，出口金額比2010年同比增長50.90%[2]。目前國際貿易中對果汁中耐熱菌有嚴格要求，是蘋果濃縮汁的必檢項目，也是當前中國蘋果濃縮汁出口中所遭遇的主要技術壁壘之一和蘋果濃縮汁生產中急待解決的問題。

目前檢測酸土環脂芽孢桿菌方法[3]主要有傳統的微生物培養生理生化檢測法和分子生物學聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法，傳統的微生物培養檢測法耗時耗力，整個檢測周期需耗費7～10 d；PCR法則需要昂貴的PCR儀和有分子生物學檢測技術的檢測人員，基層微生物檢測試驗室較難滿足條件。目前國內尚未檢索到用環介導等溫擴增技術檢測酸土環脂芽孢桿菌的報道。

環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等[4]建立的一種新的核酸擴增方法，其原理是針對靶基因的6 個特異區域，設計4 條特異性引物（分別為上游外引物（F3）、下游外引物（B3）、上游內引物（FIP）和下游內引物（BIP）及具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地擴增DNA，在l h內能達到109靶序列拷貝，通過觀察副產物焦磷酸鎂沉淀的濁度或者熒光染料亮度即可判斷反應是否發生。因其不需要昂貴的儀器，在水浴鍋里保持恒溫，60 min內即可高效擴增目的DNA上億倍，且可以通過目測判斷結果，所以適合在基層應用和推廣，用于大量樣品的快速檢測和篩選。

本研究旨在建立一種快速、準確檢測食品中酸土環脂芽孢桿菌的方法并進行實際應用，以滿足進出口水果濃縮汁快速檢測的需要，旨在為實現與國際檢測技術接軌提供更多的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

酸土環脂芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris，ATCC 49025）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli，ATCC 8739）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium，CMCC(B) 50115）、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae，CMCC 51528（5））、單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，CMCC(B) 54002）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa，CMCC(B) 10104）中國食品藥品檢定研究院；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，CICC10012）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，CICC10322）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium，CICC10448）和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus Cereus，CICC20551） 中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑與儀器

甜菜堿 美國Sigma公司；dNTPs、SYBR Green Ⅰ染料 上海生工生物工程有限公司；Bst DNA聚合酶大片段 美國NEB公司；其他試劑均為分析純級。

TGRADIENT 96梯度PCR儀 德國Biometra公司；FIREREADER凝膠成像儀 英國UVItec公司；600水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠；LAMP反應管 廣州華峰生物科技有限公司。

1.1.3 引物

根據GenBank中酸土環脂芽孢桿菌16S序列，設計了4條特異性引物，即F3、B3、FIP和BIP，其序列依次為：

F3：5’-CGGCGCATTAGCTAGTTGG-3’

B3：5’-ACTCTCCTTGTCGCTCTCC-3’

FIP：5’-TGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGAGGTAACGGCTCACCAAG-3’

BIP：5’-TAGGGAATCTTCCGCAATGGGCAGAGCTTTACAACCCGAAGG-3’

以上引物均委托上海生工生物工程技術公司合成。

1.1.4 培養基與果汁樣品

YSG液體培養基（酵母膏2 g、葡萄糖1 g、可溶性淀粉2 g，溶于1 L蒸餾水中，用1 mol/L鹽酸調節pH（3.7±0.1），121 ℃滅菌15 min）；蘋果汁、橙汁和菠蘿汁均為福建綠泉食品有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細菌DNA的提取

取酸土環脂芽孢桿菌菌液1 mL加到1.5 mL無菌離心管中，10 000×g離心2 min，盡量吸棄上清液；加入100 μL TE-Trinton，混勻后沸水浴10 min；12 000×g離心2 min，上清液即為模板DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.2 LAMP反應體系初建

根據文獻[5]，初步設定LAMP反應體系：內外引物比為8∶1，FIP和BIP各1.6 ?mol/L，F3和B3各0.2 ?mol/L，dNTP Mixture 1.6 mmol/L，ThermoPol緩沖液1×，甜菜堿0.8 mol/L，MgSO48 mmol/L，DNA模板2 ?L，8 U Bst DNA聚合酶0.5 ?L，加雙蒸水至25 ?L。反應混合物先在95 ℃加熱5 min使DNA解鏈，放在冰上冷卻5 min后加8 U Bst DNA 聚合酶大片段，然后在63 ℃孵育60 min，最后在80 ℃、10 min終止反應。反應完成后，加入1000×SYBR Green Ⅰ 2 ?L，輕輕混勻并在白色背景下觀察。實驗3 個重復，同時做空白對照。

1.2.3 LAMP反應體系優化

反應體系（25 ?L）分別進行酶添加量、反應時間、反應溫度和引物濃度優化，每組反應進行3 個重復。酶添加量分別為4、8、12、16、20 U；反應時間分別設為30、45、60、75、90 min；反應溫度分別設為60、61、62、63、64、65 ℃；引物濃度設置：根據LAMP文獻[5]等多個LAMP研究，LAMP內外引物比在8∶1反應效果較好，設定內外引物比為8∶1，然后分別設定外引物的終濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μmol/L，同時根據8∶1的比例添加相應的內引物進行實驗。

1.2.4 特異性實驗

用食品中常見致病菌大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌進行驗證；同時選取果汁中常見的枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌進行特異性驗證。提取以上各種菌基因組DNA，用1.2.2節方法進行檢測，驗證該方法檢測酸土環脂芽孢桿菌的種屬特異性。

1.2.5 敏感性實驗

將酸土環脂芽孢桿菌標準菌株經YSG液體培養基，過夜培養后，增菌液以10 倍遞增稀釋至106倍，每一稀釋倍數菌懸液分別取1 mL，進行菌落計數，每組設3 個重復；然后再分別取上述每個稀釋度菌懸液1 mL提取其DNA，同時用雙蒸水為空白對照，依據1.2.2節方法進行檢測，確定該方法的檢出限。

1.2.6 食品樣品檢測

取經PCR檢測酸土環脂芽孢桿菌陰性的蘋果汁、橙汁和菠蘿汁各100 mL，分裝入3 根無菌的試管，并分別接入濁度0.6的酸土環脂芽孢桿菌液10 μL，混勻后45 ℃培養48 h；同時另取相應酸土環脂芽孢桿菌陰性的果汁在45 ℃培養48 h作為陰性對照；各取1 mL用1.2.1節方法提取DNA，按酸土環脂芽孢桿菌LAMP檢測優選方案進行LAMP擴增檢測。

2 結果與分析

2.1 酸土環脂芽孢桿菌LAMP反應初建體系實驗

酸土環脂芽孢桿菌反應管3個重復實驗結果均為特異性綠色，空白對照為橙色。陽性結果跟空白對照結果如圖1所示。

圖1 酸土環脂芽孢桿菌LAMP檢測結果Fig.1 LAMP results of A. acidoterrestris

2.2 反應體系優化實驗結果

反應溫度60、61、62、63、64、65 ℃均能擴增目的產物顯綠色，各管顏色沒明顯差異；3 組重復性實驗沒有差異。25 ?L反應體系酶添加量分別為4、8、12、16、20 U，均能擴增目的產物顯色，各管顏色沒明顯差異；3 組重復性實驗沒有差異。

圖2 反應時間對LAMP的影響Fig.2 Effect of reaction time on the LAMP

由圖2可知，反應30 min時實驗結果有轉綠，但綠色比較淺（弱陽性），反應45 min以后各管顏色均顯示綠色且沒明顯差異；3 組重復性實驗沒有明顯的組間差異。

圖3 引物濃度對LAMP的影響Fig.3 Effect of primer concentrations on the LAMP

由圖3可見，引物終濃度為0.4 μmol/L顯示為陰性，0.8 μmol/L為弱陽性，1.2 μmol/L及以上的濃度為陽性；3 組重復性實驗沒有明顯的組間差異。

通過對各個反應條件進行實驗，在反應體系體積為25μL的條件下，反應體系的優選方案為：外引物1、2各0.15 μmol/L；內引物1、2各1.2 μmol/L；Bst DNA聚合酶，0.16 U/μL；DNA模板，2.0 μL。63 ℃擴增60 min后，每個反應管中加入1 000×SYBR Green Ⅰ 2 ?L，輕輕混勻并在白色背景下觀察。

2.3 特異性實驗

圖4 酸土環脂芽孢桿菌特異性實驗結果Fig.4 Specificity of the LAMP method for A. acidoterrestris

由圖4可見，只有酸土環脂芽孢桿菌反應管為特異性綠色，其余均為橙色。3 組重復性實驗沒有出現明顯的組間差異，說明該反應體系特異性好。

2.4 靈敏度實驗

對酸土環脂芽孢桿菌各個稀釋度的菌懸液進行檢測后，結果如圖5所示，稀釋度為100～105倍時，反應管均顯示綠色，106稀釋度為淺綠色，空白對照管為橙色。實驗重復了3組，3組實驗結果沒有大的差異，最后根據菌落計數結果取3 組數據的平均值， 105稀釋度細菌濃度對應的平皿菌落計數平均值為58 CFU/mL（具體數值分別為60、64、50 CFU/mL），106稀釋度細菌濃度為6.7 CFU/mL（具體數值分別為5、7、8 CFU/mL）；可以判斷，本研究建立的酸土環脂芽孢桿菌方法的最低檢出限可達到10 CFU/mL以內，但綠色較淺，肉眼判斷有一定的誤判可能；在細菌濃度升高一個數量級后（平均值為58 CFU/mL）以后則顯示明顯的強陽性。

圖5 酸土環脂芽孢桿菌LAMP 檢測靈敏度結果Fig.5 Sensitivity of the LAMP method for A. acidoterrestris

2.5 食品樣品檢測結果

在添加酸土環脂芽孢桿菌的蘋果汁、橙汁和菠蘿汁均檢測出酸土環脂芽孢桿菌陽性，而未添加酸土環脂芽孢桿菌的果汁則為酸土環脂芽孢桿菌陰性，證明本檢測方法能夠從食品中檢出酸土環脂芽孢桿菌，結果見圖6。實驗重復3 次，結果一致。

圖6 加標果汁樣品LAMP檢測結果Fig.6 Results obtained for the detection of spiked juice samples by the LMAP method

2.6 LAMP 專用反應管

圖7 LAMP 專用反應管Fig.7 Special reaction tube of LAMP

LAMP法由于產物濃度高，后續染色的時候容易產生污染，導致后續實驗產生假陽性，本研究采用特制的LAMP反應管，如圖6所示，在普通的離心管中加設一隔板2，將離心管分隔成小腔1和大腔3，大腔作為反應室，小腔中作為染料室，反應結束后，只需上下顛倒反應管即可染色，不需開蓋，降低了污染概率。

3 討論與結論

酸土環脂芽孢桿菌作為污染果汁的主要菌種受到人們的廣泛關注。目前對于酸土環脂芽孢桿菌的檢測手段仍停留在傳統的分離培養和后續的生理生化鑒定上。傳統的方法不但操作繁瑣，而且檢測周期很長。PCR技術是目前一種微生物常用的快速檢測方法，有熒光定量PCR法[6-9]和普通PCR法[10-11]，但其檢測過程需要PCR儀、電泳儀和凝膠成像系統等貴重儀器，且對操作人員技術水平要求較高，這些問題造成PCR技術難以在基層推廣。LAMP彌補了PCR技術的不足，不需要貴重儀器，操作簡便，反應時間短，適合推廣；目前很多研究已經采用LAMP檢測，如病原菌檢測[12-16]、病毒檢測[17-21]、寄生蟲檢測[22-24]、轉基因檢測[25]等。常見的LAMP產物的檢測方法有濁度法、顯色法、熒光法和凝膠電泳法；濁度法分辨率較低，熒光法和凝膠電泳法則需要相關設備，本研究采用方便性和靈敏度俱佳的顯色法檢測，在菌液濃度60 CFU/mL具有強陽性，與Connor等[26]的實時熒光定量PCR法的靈敏度相當。研究中采用煮沸法提取模板DNA，并用其進行LAMP擴增，結果均能檢測出目的菌，在保證方法特異性的前提下能達到方便、快速的目的。用該方法對食品中常見的致病菌做特異性檢驗，均未出現假陽性結果，顯示了良好的特異性。LAMP法由于產物濃度高，后續染色的時候容易產生污染，導致后續的實驗產生假陽性，本研究采用特制的LAMP反應管，不需開蓋即可染色，降低的終產物污染的概率。

綜上所述，本研究建立的酸土環脂芽孢桿菌LAMP檢測方法，具有特異性強，靈敏度高，方便、快捷，成本低等特點，適用于食品中酸土環脂芽孢桿菌的快速檢測。

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Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) for Detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in Foods

ZHOU Zan-hu1,2, ZHANG Hai-yan3, ZHENG Jun-chao2, JIANG Zhe-min2, CHEN Chun-xiang2, HE Yi-zhen2, LIN Jun-jun2, SU Xue-qin2, WANG Gen-fang2, ZHENG Tian-ling1,*
(1. Key Laboratory of Coastal and Wetland Ecosystems, Ministry of Education, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China; 2. Zhangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhangzhou 363000, China; 3. College of Zhangzhou Health Vocational, Zhangzhou 363000, China)

Purpose: A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method was established for the detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in foods. Methods: After optimization of the reaction conditions of LAMP including the concentrations of primers, reaction time and amplification temperature, the LAMP method was developed, and its sensitivity and specificity were evaluated. Results: The method was capable of rapidly and specifically detecting A. acidoterrestris in foods within 1 hour at a constant temperature of 63 ℃. The sensitivity of the method was 6.7 CFU/mL and the specificity was 100%. Conclusions: The LAMP method is efficient, highly sensitive and specific, and suitable for the rapid detection of A. acidoterrestris in various food samples.

loop-mediated isothermal amplification (LAMP); Alicyclobacillus acidoterrestris; food

S182

A

1002-6630（2014）22-0233-05

10.7506/spkx1002-6630-201422045

2014-01-07

福建省漳州市自然科學基金項目（ZZ2012J16）

周贊虎（1973—），男，高級工程師，博士，研究方向為微生物與分子生物學。E-mail：24345460@qq.com

*通信作者：鄭天凌（1955—），男，教授，博士，研究方向為海洋微生物生態學。E-mail：24345460@qq.com