采后檸檬酸處理對蘋果青霉病的控制及其貯藏品質的影響

葛永紅，李燦嬰，朱丹實，李穎琦，劉 婧

（1.渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧 錦州 121013；2.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

采后檸檬酸處理對蘋果青霉病的控制及其貯藏品質的影響

葛永紅1，李燦嬰1，朱丹實1，李穎琦2，劉 婧2

（1.渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧 錦州 121013；2.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

以蘋果為原料，研究不同質量分數檸檬酸常溫浸泡處理對損傷接種擴展青霉（Penicillium expansum）果實病斑擴展的抑制效果及貯藏品質的影響。結果表明：離體條件下檸檬酸能夠抑制P. expansum的孢子萌發，其中以1%質量分數效果最佳，1%檸檬酸處理顯著降低了損傷接種蘋果果實P. expansum病斑直徑；檸檬酸處理顯著提高了果實過氧化物酶、過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶活性。此外，檸檬酸處理還有效延緩了果實質量損失率的升高，抑制果實硬度、抗壞血酸含量、可滴定酸和可溶性固形物質量分數的下降，且推遲了果實呼吸高峰的出現。

檸檬酸；蘋果果實；品質；采后

蘋果（Malus domestica Borkh）屬躍變型果實，在采后貯藏、運輸和銷售過程中很容易腐爛變質，給生產者和經營者帶來巨大的經濟損失[1]。果實的品質劣變主要是由于水分蒸騰、果膠物質降解、呼吸消耗等所致，同時營養物質的消耗也在一定程度上降低了果實的抗病性。因此，延緩采后果實的衰老及病害控制是提高蘋果品質及延長貯藏期的重要措施。貯運過程中由擴展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是主要采后病害之一，目前最有效的方法還是依靠化學殺菌劑[2-3]。隨著人們對食品安全性和環境污染的重視，化學殺菌劑在果實采后病害防治中的應用逐漸受到限制。采用安全、持續、廣譜和無環境污染的采后防腐保鮮措施已成為當前的研究熱點[4]。

檸檬酸是果實體內存在的一種重要有機酸，參與組織呼吸代謝等生理代謝過程，也是一種有效的非生物誘抗劑。已有研究報道，采后檸檬酸處理能夠延緩蠶豆[5]、芒果[6]、鴨梨[7]、棗[8]等果實的衰老進程。采后檸檬酸處理抑制了馬鈴薯硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）引起的干腐病的發生[9]、甜瓜果實損傷接種互隔交鏈孢（Alternaria alternata）的病斑擴展[10]。進一步研究表明檸檬酸處理提高果實抗病性與提高果實β-1,3-葡聚糖酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性，促進類黃酮、酚類和木質素等抗性物質的顯著積累密切相關[9-10]。有關檸檬酸處理對蘋果青霉病的控制及貯藏品質的影響尚未見報道。

本實驗以蘋果為原料，研究采后檸檬酸處理對P. expansum孢子萌發及損傷接種P. expansum果實病斑擴展的影響，探索檸檬酸處理對果實抗氧化酶活性及貯藏品質的影響，以期為檸檬酸在果蔬貯藏保鮮中的進一步應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試青冠蘋果果實2013年8月采自甘肅省景泰條山農場，在八成熟時采收，單果套發泡網袋后紙箱包裝當天運回實驗室常溫貯藏待用（溫度（20±2）℃，相對濕度45%）。供試P. expansum分離自自然發病的蘋果果實，純化后在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基上培養待用。

PDA培養基配方：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中。

檸檬酸（分析純） 天津永晟精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2450型分光光度計 日本島津公司；H-1850R型離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；GY-1型水果硬度計 杭州托普儀器有限公司；WYT-32型阿貝折光儀 廈門中村光學儀器廠；GXH-3051H型紅外CO2果蔬呼吸測定儀 北京均方理化科技研究所。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選擇大小一致、無機械損傷和病蟲害的果實，表面清洗后用質量分數1%、2%、4%檸檬酸溶液（含體積分數0.05%的吐溫80）浸泡處理10 min，待晾干后包裝常溫貯藏待用（溫度（20±2）℃，相對濕度45%）。用清水處理作對照（CK），每處理15 個果實，重復3 次。

1.3.2 孢子懸浮液的配制

參照Bi Yang等[11]方法。取25 ℃條件下培養7 d的帶菌PDA平皿一個，加入含0.05%吐溫80的無菌水約10 mL，用玻璃棒刮下PDA平板上的病原菌孢子，然后轉入50 mL三角瓶中，在WYX-A微型旋渦混合器上振蕩15 s，再用雙層紗布過濾，濾液用血球計數板計數算出孢子懸浮液的孢子含量，最后稀釋至所需含量（1×105個/mL）。

1.3.3 孢子萌發實驗

將配制好的P. expansum孢子懸浮液加入到經滅菌的含有1%、2%、4%檸檬酸的馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose，PD）培養基中，然后在25 ℃條件下培養，當對照孢子萌發數達到80%以上時，統計各處理孢子萌發數并計算孢子萌發率。

1.3.4 損傷接種

參照Bi Yang等[11]方法。各處理果實先經75%酒精表面消毒，然后用滅菌鐵釘在果實赤道部位均勻刺孔4 個（深3 mm，直徑3 mm），晾干后分別取20 μL含量為1×105個/mL的P. expansum孢子懸浮液接種于孔內，晾干后裝箱用PE膜包裝保濕，室溫貯藏第4天開始，每隔1d觀察發病率，并用十字交叉法測量病斑直徑，篩選出最佳檸檬酸質量分數。

1.3.5 取樣方法

分別于1%檸檬酸和清水處理后0、2、4、6、8 d用直徑5 mm打孔器取皮下10～15 mm處果肉組織3 g，用錫箔紙包好，液氮冷凍后在-80 ℃低溫冰箱中保存備用。

1.3.6 呼吸強度測定

用GXH-3051H型果蔬呼吸測定儀測定果實呼吸強度。取果實30 個，在果實貯藏第0、2、4、6、8天測定果實在12 min內的CO2產生量，呼吸強度以mL CO2/（kg·h）表示。

1.3.7 可溶性固形物含量和硬度測定

參照曹建康等[7]的方法。用阿貝折光儀和硬度計在果實貯藏第0、2、4、6、8天測定果肉可溶性固形物含量和硬度。每個果實測4 個點（陽面、陰面各兩點），每處理用果實10 個，重復3 次。

1.3.8 可滴定酸和抗壞血酸含量測定

可滴定酸含量測定參照韓雅珊[12]方法并修改。10.0 g樣品磨碎，用已煮沸、冷卻的蒸餾水移入100 mL的容量瓶中定容，過濾。吸取濾液10 mL，加入2～3 滴1%酚酞指示劑，用標定后的0.01 mol/L NaOH溶液滴定。果實可滴定酸含量以蘋果酸（換算系數為0.067）進行計算。

抗壞血酸含量測定參照任亞琳等[13]方法。3.0 g果肉組織加5 mL預冷的100 mmol/L鹽酸充分研磨，在4 ℃、10 000×g條件下離心10 min，取上清液100 ?L加入2 mL 100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）再加入0.5 mL蒸餾水在265 nm波長處測定其吸光度，并以抗壞血酸制作標準曲線。以每克鮮質量的抗壞血酸質量表示抗壞血酸含量。

1.3.9 質量損失率的測定

參照任邦來等[14]的方法并修改。稱量法測量果實的質量，采用差量法計算。每處理10 個果實，重復3 次。

1.3.10 抗性酶活性測定

過氧化物酶（peroxidase，POD）活性的測定參照葛永紅等[10]方法。酶活性以每分鐘吸光度變化0.01為1 個活性單位（U），POD活性以U/g表示。

抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性測定參照Ren Yaling等[15]方法。以每分鐘反應體系吸光度變化0.01定義為1 個酶活性單位（U），APX活性以U/g表示。

過氧化氫酶（catalase，CAT）活性測定參照Cao Jiankang等[16]方法。取3 g果肉，加入1 mL預冷pH 7.5的0.05 mol/L磷酸緩沖液（內含50 mmol/L二硫蘇糖醇和1%交聯聚乙烯吡咯烷酮）在冰浴中研成勻漿，12 000×g、4 ℃條件下離心20 min，收集上清液立即用于CAT酶活測定。CAT反應體系包括粗酶液100 μL和3 mL 20 mmol/L的H2O2，以蒸餾水作參比。在240 nm波長處測定2 min時的樣品吸光度。CAT活性以U/g表示。

1.4 數據處理

實驗數據用Microsoft Excel 2007計算標準誤差并作圖，SPSS V17.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 檸檬酸處理對P. expansum孢子萌發的影響

P. expansum在培養24 h后孢子大量萌發，對照萌發率達到90%，不同質量分數檸檬酸處理均抑制了孢子萌發，其中以1%和2%檸檬酸處理的孢子萌發率與對照有顯著性差異，其中以1%檸檬酸處理的萌發率最低（圖1）。

圖1 檸檬酸處理對P. expansum孢子萌發的影響Fig.1 Effect of postharvest citric acid treatment on spore germination of P. expansum

圖2 采后檸檬酸處理對損傷接種P. expansum蘋果病斑直徑的影響Fig.2 Effect of postharvest citric acid treatment on lesion diameter in apple fruits inoculated with P. expansum

2.2 檸檬酸處理對損傷接種P. expansum蘋果果實病斑直徑的影響隨著貯藏時間的延長，接種蘋果果實病斑直徑逐漸增大，1%、2%和4%檸檬酸處理均降低了損傷接種蘋果果實P. expansum病斑直徑，其中只有1%檸檬酸與對照間有顯著性差異，高含量的檸檬酸沒有進一步抑制果實病斑擴展（圖2）。

2.3 檸檬酸處理對蘋果果實質量損失率的影響

圖3 采后1 檸檬酸處理對常溫貯藏期間蘋果果實質量損失率的影響Fig.3 Effect of postharvest 1% citric acid treatment on weight loss in apple fruits during storage at room temperature

隨著貯藏時間的延長，對照和處理蘋果果實質量損失率逐漸增加，但1%檸檬酸處理果實的質量損失率明顯低于對照，在貯藏4、6、8 d后顯著低于對照，分別較對照組果實低43.6%、26.3%和39%（圖3）。

2.4 檸檬酸處理對蘋果果實呼吸強度的影響

圖4 采后1 檸檬酸處理對常溫貯藏期間蘋果果實呼吸強度的影響Fig.4 Effect of postharvest 1% citric acid treatment on respiration intensity of apple fruits during storage at room temperature

蘋果屬于典型的呼吸躍變型果實，常溫貯藏過程中果實呼吸強度先升高后下降，在貯藏第4天出現峰值，但1%檸檬酸處理推遲了呼吸高峰的出現（圖4）。說明檸檬酸處理有利于延緩果實的衰老進程。

2.5 檸檬酸處理對蘋果果實硬度和可溶性固形物質量分數的影響

整個常溫貯藏期間，處理和對照組果實硬度均呈逐漸下降趨勢，但檸檬酸處理明顯延緩了果實硬度的下降速率（圖5A）。果實可溶性固形物質量分數呈先升高后降低的趨勢，檸檬酸處理組果實可溶性固形物質量分數在貯藏前期低于對照，貯藏6d后高于對照（圖5B）。由此說明，檸檬酸處理在一定程度上延緩了果實可溶性固形物質量分數的下降。

2.6 檸檬酸處理對蘋果果實可滴定酸質量分數和抗壞血酸含量的影響

圖6 采后1 檸檬酸處理對常溫貯藏期間蘋果果實可滴定酸質量分數（A）和抗壞血酸含量（B）的影響Fig.6 Effect of postharvest 1% citric acid treatment on titratable acid (A) and ascorbic acid (B) contents in apple fruits during storage at room temperature

隨著貯藏時間的延長，果實可滴定酸質量分數逐漸下降，檸檬酸處理果實可滴定酸質量分數高于對照果實，但差異不顯著（圖6A）。抗壞血酸含量隨著貯藏時間的延長先降低后升高再降低趨勢，檸檬酸處理顯著維持了高水平的抗壞血酸，并且在第貯藏第6天出現峰值，高出對照36.5%（圖6B）。

2.7 檸檬酸處理對蘋果果實抗性酶活性的影響

圖7 采后1 檸檬酸處理對蘋果果實POD（A）、CAT（B）和APX（C）活性的影響Fig.7 Effect of postharvest 1% citric acid treatment on POD (A), CAT (B) and APX (C) activities in apple fruits

整個貯藏期間，對照和處理果實POD活性呈先升高后降低趨勢，但檸檬酸處理顯著提高了蘋果果實POD活性，其中在貯藏第4天和第6天差異最顯著，分別高出對照52%和39.3%（圖7A）。檸檬酸處理也顯著提高蘋果果實CAT和APX活性，兩者均在貯藏第4天出現峰值，分別高于對照19.3%和22.2%（圖7B、C）。

3 討 論

本實驗研究表明，不同質量分數檸檬酸均能抑制處理后損傷接種P. expansum蘋果果實的病斑直徑，其中以1%檸檬酸處理的抑制效果最佳。離體條件下檸檬酸對P. expansum的孢子萌發有明顯抑制作用，其中1%檸檬酸抑制率最大。葛永紅等[10]研究發現，離體條件下檸檬酸處理抑制了A. alternata菌絲生長，其中以2%檸檬酸效果最佳。并且，2%檸檬酸處理能夠有效抑制處理后損傷接種A. alternata甜瓜果實的病斑直徑。由此表明，檸檬酸處理的質量分數會對其控制腐爛的效果產生明顯的影響，本實驗所篩選1%檸檬酸處理對損傷接種病原物的抑制效果最佳，過高質量分數效果并不明顯。在馬鈴薯上的研究[9]也發現，檸檬酸誘導產生的抗病性與其質量分數有關，高質量分數效果不明顯且產生藥害。采后蘋果酸誘導蘋果果實抗病性的研究[17]也發現高含量的蘋果酸并不能降低果實采后青霉病。這可能是高含量的有機酸影響了果實的呼吸或其他代謝。說明只有一定含量的檸檬酸才能有效啟動果實的防衛反應，更高含量并不能增加防衛反應的強度，并且檸檬酸的含量因果實和病原物的不同而存在明顯的差異。

檸檬酸處理對蘋果青霉病的抑制與其激活防御酶活性密切相關。據報道，多種防御酶在產品的抗病性反應中具有積極的作用[18]。1%檸檬酸處理后果實體內APX、POD和CAT活性顯著升高。在果實體內POD參與木質素的合成，以及細胞壁的交聯化反應，從而加固細胞壁抵抗病原物的侵染[19-20]。此外，POD也參與細胞內活性氧的清除，避免活性氧的過量積累[19]。厚皮甜瓜果實上的研究也發現，采后檸檬酸處理誘導了果實體內POD活性的升高，從而提高了果實的抗病性[10]。CAT專一地作用于H2O2，將H2O2分解為水和氧氣，從而降低了H2O2的積累，減少對寄主的傷害[20]。APX能夠經抗壞血酸-谷胱甘肽循環分解H2O2為水分子[15]。越來越多的研究證明，抗氧化酶的協同作用比單一酶在植物抗氧化過程中更具重要性[9]。由此表明，檸檬酸處理提高蘋果果實的抗病性與體內抗氧化酶活性的提高密切有關。檸檬酸誘導果實抗病性的提高還與活化果實體內苯丙烷代謝關鍵酶活性提高和抗菌物質的積累有關[9-10]。

果實采收后依然是鮮活的個體，為維持其正常生理功能必然要消耗體內的一些營養物質，從而造成品質的下降，而品質劣變和果實衰老是限制果實貯藏的主要因素。這些品質成分包括水分、香氣物質、果膠物質、糖、酸、抗壞血酸等[21]。本實驗結果表明，蘋果果實在貯藏期間硬度、可滴定酸質量分數下降，可溶性固形物質量分數和抗壞血酸含量先升高后下降，呼吸強度升高出現呼吸高峰后開始下降，質量損失率逐漸增加，說明果實逐漸進入衰老階段，檸檬酸處理能夠有效減緩果實硬度、抗壞血酸含量、可滴定酸和可溶性固形物質量分數的下降及質量損失率的升高，并且推遲了果實呼吸高峰的出現，從而延緩果實采后衰老速率，延長了其貯藏時間。曹建康等[7]在鴨梨果實上的研究發現，采后檸檬酸處理有效延緩了貯藏過程中果實硬度、可溶性固形物、可滴定酸和抗壞血酸含量的下降。因此，檸檬酸處理能明顯保持果實品質和增加耐貯性。

4 結 論

離體條件下1%檸檬酸顯著抑制了P. expansum的孢子萌發，顯著降低了損傷接種蘋果果實P. expansum病斑直徑。檸檬酸處理顯著提高果實POD、CAT和APX活性，同時還有效延緩了果實質量損失率的升高，抑制果實硬度、抗壞血酸含量、可滴定酸和可溶性固形物質量分數的下降，并且推遲了果實呼吸高峰的出現，從而延緩果實采后衰老速率，延長了其貯藏期。

[1] 邵興鋒, 屠康, 靜瑋, 等. 熱處理對紅富士蘋果貯藏期間青霉病的抑制效果[J]. 園藝學報, 2007, 34(3): 743-746.

[2] SPADARO D, VOLA R, PIANO S, et al. Mechanism of action and efficacy of four isolates of the yeast Metschinikowia pulcherrima active against post-harvest pathogens on apples[J]. Postharvest Biology and Technology, 2002, 24(2): 123-134.

[3] CALVO J, CALVENTE V, de ORELLANO M E, et al. Biological control of postharvest spoilage caused by Penicillium expansum and Botrytis cinerea in apple by using the bacterium Rhonella aquatilis[J]. International Journal Food Microbiology, 2007, 113(3): 251-257.

[4] DROBY S, WISNIEWSKI M, MACARISIN D, et al. Twenty years of postharvest biocontrol research: Is it time for a new paradigm[J]. Postharvest Biology and Technology, 2009, 52(2): 137-145.

[5] 張蘭, 鄭永華, 蘇新國, 等. 酸處理對蠶豆保鮮的效果[J]. 食品工業科技, 2003, 24(4): 76-77.

[6] 鄭小林, 吳小業. 檸檬酸處理對采后芒果保鮮效果的影響[J]. 食品科學, 2010, 31(18): 381-384.

[7] 曹建康, 姜微波. 檸檬酸處理對鴨梨果實貯藏特性的影響[J]. 食品科技, 2005, 30(10): 84-87.

[8] ZHAO Z H, LIU M J, LIU P, et al. Effects of citric acid treatments on the postharvest fruit quality of Ziziphus jujuba Mill. ‘Linyilizao’[J]. Acta Horticulturae, 2009, 840: 513-516.

[9] 張慶春, 李永才, 畢陽, 等. 檸檬酸處理對馬鈴薯干腐病的抑制作用及防御酶活性的影響[J]. 甘肅農業大學學報, 2009, 44(3): 146-150.

[10] 葛永紅, 王毅, 畢陽. 檸檬酸處理對厚皮甜瓜黑斑病的抑制及苯丙烷代謝的作用[J]. 食品工業科技, 2013, 34(19): 308-311.

[11] BI Yang, TIAN Shiping, ZHAO Jie, et al. Harpin induces local and systemic resistance against Trichothecium roseumin harvested hami melons[J]. Postharvest Biology and Technology, 2005, 38(2): 183-187.

[12] 韓雅珊. 食品化學實驗指導[M]. 北京: 中國農業大學出版社, 1992: 66-72.

[13] 任亞琳, 畢陽, 葛永紅, 等. BTH浸泡處理對厚皮甜瓜采后病害的控制及貯藏品質的影響[J]. 食品科學, 2013, 34(2): 267-272.

[14] 任邦來, 張燕. 水楊酸對番茄保鮮效果的影響[J]. 中國食物與營養, 2012, 18(7): 37-40.

[15] REN Yaling, WANG Yunfei, BI Yang, et al. Postharvest BTH treatment induced disease resistance and enhanced reactive oxygen species metabolism in muskmelon (Cucumis melo L.) fruit[J]. European Food Research and Technology, 2012, 234: 963-969.

[16] CAO Jiankang, JIANG Weibo. Induction of resistance in Yali pear (Pyrus bretschneideri Rehd.) fruit against postharvest diseases by acibenzolar-S-methyl sprays on trees during fruit growth[J]. Scientia Horticulturae, 2006, 110: 181-186.

[17] 伍利芬, 畢陽, 李紅霞, 等. 蘋果酸處理對蘋果青霉病的控制和抗性的誘導[J]. 食品工業, 2012, 33(3): 42-44.

[18] SMITH C J. Accumulation of phytoalexins: defense mechanism and stimulus response[J]. Phytopathology, 1996, 132: 1-45.

[19] 葛永紅, 畢陽, 李永才, 等. 苯并噻重氮(ASM)對果蔬采后抗病性的誘導及機理[J]. 中國農業科學, 2012, 45(16): 3357-3362.

[20] BRISSON L F, TENHAKEN R. Function of oxidative cross-linking of cell wall structural proteins in plant disease resistance[J]. Plant cell, 1994, 6: 1703-1712．

[21] 潘騰飛, 李永裕, 邱棟梁. 果實品質形成的分子機理研究進展[J]. 亞熱帶植物科學, 2006, 35(1): 81-84.

Effect of Postharvest Citric Acid Treatment on Controlling Blue Mould and Preserving the Quality of Apple Fruits during Storage

GE Yong-hong1, LI Can-ying1, ZHU Dan-shi1, LI Ying-qi2, LIU Jing2
(1. College of Chemistry, Chemical Engineering and Food Safety, Bohai University, Jinzhou 121013, China; 2. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Apple (cv. Qingguan) fruits which had been wounded and artificially inoculated with Penicillium expansum were subjected to dipping treatments with different concentrations of citric acid and subsequent storage at room temperature in order to investigate the inhibition of lesion development and the preservation of apple fruit by citric acid treatment. In vitro test indicated that citric acid inhibited spore germination of P. expansum, and 1% citric acid showed the highest inhibitory rate. In vivo test indicated that 1% citric acid was the optimal concentration for controlling blue mould of apple fruits. Postharvest citric acid treatment significantly increased the activities of peroxidase (POD), catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX), delayed the increase in weight loss and the decreases in hardness and the contents of titratable acid, ascorbic acid and soluble solid, and postponed the respiration peak in apple fruits.

citric acid; apple fruit; quality; postharvest

TS255.3

A

1002-6630（2014）22-0255-05

10.7506/spkx1002-6630-201422050

2014-04-11

國家自然科學基金地區科學基金項目（31160405）；渤海大學博士啟動基金項目（bsqd201405）；遼寧省食品安全重點實驗室開放課題項目（LNSAKF2013021）

葛永紅（1979—），男，副教授，博士，研究方向為果蔬貯藏與保鮮。E-mail：geyh1979@163.com