南極普里茲灣可培養浮游細菌群落結構研究

吳月紅 韓正兵 張心齊 周亞東 吳敏 許學偉

0 引言

南極普里茲灣存在季節性的海冰區域，其表層水體物理性質與普通大洋海水不同，影響了該生態系統中浮游微生物的群落結構和功能。熒光原位顯微技術表明，γ-變形桿菌綱、放線菌綱和擬桿菌門細菌是極地海洋浮游細菌的主要類群［1］，特別是Cytophaga／Flavobacter（CF）類群，在南極生態系統中有廣泛的分布。在南極表層細菌可培養微生物研究中，γ-變形桿菌綱為最主要類群，冷單胞菌屬（Psychromonas）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）占總分離菌株數的65.4%，在南極浮游細菌群落中具有重要作用。

由于受采樣等條件限制，目前對南極普里茲灣浮游細菌群落結構的研究相對較少。以往研究者對南極浮游細菌多樣性研究［1-2］多采用分子生物學技術，這種方法能獲得較全面的微生物信息。然而分離培養是微生物學一項重要的研究，獲得的純培養物往往是環境微生物群落中最能反映生態環境特征的類群，是處于活性狀態下的微生物類群，這對于評估微生物與環境的關系至關重要，更是后續生理特性研究的基礎［3］。因此，菌株分離純化一直受到微生物學家的高度重視。

在微生物培養過程中，個別類型微生物由于數量占優或生長速度較快等原因，在培養初期大量生長，從而掩蓋了數量少、生長速度慢的菌株；此外，高濃度的營養物質對一些微生物具有毒性。寡營養培養方式是解決該問題的有效技術手段［4］。本研究采用寡營養培養方法，對南極普里茲灣內達恩利角附近海域3個測站共12份海水樣品進行微生物分離培養，獲得95株細菌菌株并進行初步分類鑒定，研究工作有助于深入認識南極普里茲灣夏季浮游細菌群落變化及其在生態系統中的作用，對南極細菌資源評估與開發具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

第25次中國南極科學考察（2009年2月）期間，于南極普里茲灣內達恩利角附近海域利用Seabird 911 Plus CTD采水器進行海水樣品采集，站位信息與位置見表1和圖1。采樣時間為盛夏，海區浮冰消融，融冰對海洋上層水體產生淡化作用，導致普里茲灣表層水溫較高、鹽度較小、密度較低。每個測站分別采集了0、50、100和200 m水樣，樣品在實驗進行之前一直處于4℃和避光保存。

表1 站位信息表Table 1.Information of the sampling stations

圖1 普里茲灣站位圖Fig.1.Sampling stations in Prydz Bay，Antarctic

1.2 菌株分離純化

采用寡營養陳海水培養基（LMEB培養基）分離純化南極普里茲灣真光層水體微生物。LMEB配方為南極普里茲灣天然海水、蛋白胨0.5g／L和酵母提取物0.1g／L。固體培養基添加15 g／L瓊脂，滅菌后倒平板。

水樣依次稀釋10倍和100倍并涂布LMEB培養基，每個梯度涂布3塊平板，25℃培養至長出明顯菌落。根據菌落形態特征，挑取不同的單菌落在Marine 2216agar（BD）平板上劃線，25℃培養，挑取單菌落再次純化后－80℃甘油管和凍干管保存。

1.3 菌株形態特征觀察

采用活體觀察、透射電鏡觀察和掃描電鏡觀察三種方式觀察菌株形態。

活體觀察：取對數生長期菌液涂于載玻片上，通過光學顯微鏡（Olympus BX40）觀察細胞運動性及形態特征。

透射電鏡觀察：取對數生長期的劃線斜面，刮取菌體懸浮于無菌水制成菌懸液。將菌懸液滴于銅網上并用濾紙吸去多余液體，然后用醋酸雙氧鈾染色。制作細胞超薄切片時，以2.5%戊二醛固定細胞，并通過鋨酸固定、乙醇脫水、包埋、切片和醋酸雙氧鈾染色等步驟制備切片樣品。透射電鏡（JEM-1230）下觀察細胞的形態、大小、分裂方式、芽孢產生、細胞壁結構、內涵體和鞭毛數量及形態等情況。透射電鏡觀察在浙江大學分析測試中心華家池分中心完成。

掃描電鏡觀察：取對數生長期的劃線斜面刮取菌體制成菌懸液，加2.5%戊二醛固定，并通過鋨酸固定、乙醇脫水、包埋、臨界點干燥、粘臺和噴金等步驟制備樣品。掃描電鏡（Cambridge S260）下觀察細胞的形態、大小和芽孢產生等。掃描電鏡觀察在浙江大學醫學院電鏡中心完成。

1.4 菌株基因組總DNA提取

菌株于DifcoTMMarine broth 2216培養基中在25℃下培養至混濁（OD600nm＞1.0）。采用細菌基因組快速提取試劑盒N1152（東盛生物）抽提細菌總DNA。

1.5 16S rDNA序列擴增和鑒定

采用細菌特異性引物 Eubac27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，Eubac1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反應體系為50μL，10*buffer 5μL，dNTP mixture（2.5 mM each）0.5μL，primer Eubac27F（4μM）1μL，primer Eubac1492R（4μM）1μL，Taq（2.5 U／μL）0.5μL，模板 50 ng，用水補足至50μL。

PCR反應條件為 94℃，5 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min 15 s；33次循環；72℃延伸 8 min。PCR擴增產物采用ABI測序儀測序，測序引物為Eubac27F，測定的序列長度大于500 bp。測定的序列通過EzTaxon-e在線比對程序（http：∥eztaxon-e.ezbiocloud.net／）與數據庫中的已有細菌16S rDNA序列進行比對分析。序列相似性低于97%的菌株，進一步采用TA克隆方法獲取16S rRNA基因，樣品送上海生工生物工程有限公司測序，測序引物為M13-F和RV-M，序列長度大于1 300 bp，大于16S rDNA全長序列的90%。

1.6 細菌多樣性分析

根據在線比對和系統發育分析結果，將獲得的16S rRNA基因序列歸類，定義相似性＜97%的序列代表不同的分類單元。采用物種多樣性（Diversity）、豐富度（Richness）、均勻度（Eveness）和優勢度（Dominance）指數進行多樣性分析。對各分離菌株及其相近菌株的16S rRNA基因序列采用Mega 5進行多序列匹配比對，采用鄰接法（Neighbor-joiningmethod）構建系統進化樹，并通過自舉分析（Bootstrap）進行置信度檢測，自舉數據集為1 000次。

2 結果與分析

2.1 南極真光層水體細菌分離與分子鑒定

根據菌落大小、形態和顏色等特征，挑取分離平板上的單菌落進行四分劃線純化，最終從南極水樣中分離得到95株菌。以Ar-22為例，菌落淡黃色，圓形，略微凸起，直徑為1—2 mm，顯微鏡觀察發現細胞表面有凸起（圖2）。

圖2 菌株Ar-22細胞形態和超微結構.（a）掃描電鏡圖；（b）透射電鏡圖Fig.2.Cellmorphology and ultrastructure of strain Ar-22.（a）Scanning electron micrographs；（b）Transmission electronmicrographs

采用細菌通用引物，擴增獲取了95株菌株的16S rDNA序列。序列遞交至GenBank數據庫（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov），登錄號為JX844423—JX844517。分子鑒定結果表明，95株菌株可劃分至35個不同的分類單元。分離獲得 α-變形桿菌綱（Alphaproteobactia）57株，占總菌數的 60%；γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）23株，占總菌數的24.2%；擬桿菌門（Bacteroidetes）15株占總菌株15.8%。普里茲灣真光層水體中細菌垂直分布在0、50、100和200 m的4個水層中，α-變形桿菌綱均為優勢類群（61.9%、52.6%、61.3%和62.5%），其次為γ-變形桿菌綱（28.6%、26.3%、25.8%和16.7%）和擬桿菌門（9.5%、21.1%、12.9%和21.1%）。普里茲灣真光層水體中細菌水平分布表現為在P2-8、P2-11和P2-14三個站位中，α-變形桿菌綱為優勢類群（44.4%、58.3%和 70.5%），其次為 γ-變形桿菌綱（37.0%、25%和 15.9%）和擬桿菌門（18.5%、16.7%和 13.6%）。

系統發育分析結果表明，大多數菌株與之前分離自海洋或其他環境的菌株具有較高的16S rDNA序列相似性（＞97%），但也發現5個菌株與已報道菌株間的序列相似性較低，例如菌株Ar-112、Ar-125與 Bizionia echini KMM 6177T（96.3%），Ar-128與 Hoefleaalexandrii AM1V30T（96.9%），Ar-142與 Marinobacteralgicola DG893T（96.1%），Ar-121與Persicivirgaxylanidelens SW256T（95.5%）間的序列相似性均低于97%，它們可能代表了一些新的分類單元。

2.2 南極水樣細菌多樣性分析

物種多樣性是把物種的數目和個體數目分配狀況（豐度和均勻度）結合起來考慮的一個統計量，它反映了生物群落和生態系統的特征，例如結構類型、發展階段、穩定程度和生境差異等等。Shannon多樣性指數、Margalef豐富度指數是對稀有物種敏感的指數，普里茲灣海區不同水層的這些指數具有明顯的差異，不同站位多樣性指數差異不明顯，但豐富度指數差異較大。與之相反，Shannon均勻度指數和Berger-Parker優勢度指數屬于對富集種相對敏感的指數。普里茲灣海區不同水層這些指數差異不明顯，不同站位這些指數差異也不明顯（表2）?？傮w而言，不同水層的多樣性指數、豐富度指數和均勻度指數具有一定的相關性。在對數級數分布模型不是最好的理論分布時，其多樣性指數也能較好地反應物種的多樣性狀況，并且不受樣方大小的影響。通過多種方式綜合評價物種多樣性，可有效避免單一指數評價的偏頗。

普里茲灣海區細菌群落結構受到季節、溫度、營養鹽和溶解氧等因素影響而發生變化。P2-14位于陸架區，P2-8和P2-11位于陸坡區，3個站位的細菌多樣性指數和豐富度指數具有鮮明差異。位于陸架區的P2-14站位Shannon多樣性指數和Margalef豐富度指數最高，而位于陸坡區的P2-11和P2-8站位Shannon多樣性指數和Margalef豐富度指數則相對較低。這種差異可能和浮游植物生物量和生產力有關，浮游植物的代謝產物為細菌提供豐富的棲息條件。蔡昱明等研究表明，南極普里茲灣陸架區浮游植物生物量和生產力均較高，而大陸坡浮游植物的生物量和生產力則明顯降低［5］。由此推論，陸坡區和陸架區的微生物多樣性指數與浮游植物生物量和生產力呈正相關。

表2 南極普里茲灣西部細菌類群數量及多樣性指數Table 2.Number of the cultured marine bacteria and diversity indices at the western part of the Prydz Bay，Antarctic

在3個站位的不同水層中，0 m水層可培養細菌Shannon多樣性指數最低，50 m水層可培養細菌的Shannon多樣性指數和Margalef豐富度指數最高，100 m和200 m水層可培養細菌多樣性指數差距不大，這種差異可能和營養鹽豐富程度有關。在海洋生態環境中，海洋浮游細菌可以利用溶解性無機氮（Dissolved Inorganic Nitrogen，DIN）和溶解性無機磷（Dissolved Inorganic Phosphorus，DIP）作為氮源和磷源。Tupas和Koike在海洋浮游細菌室內培養實驗中發現，DIN作為主要的N源，提供了55%—99%的總N吸收，極大地促進了細菌的生長和新陳代謝［6］。此外，也有證據表明無機磷酸鹽也是浮游細菌的生物量和生產重要限制因子［7］。韓正兵等［8］研究發現3個站位的三項營養鹽（硝酸鹽、磷酸鹽和硅酸鹽）最小值均出現在表層，50 m深度以內，各項營養鹽含量快速增加，50 m達到最高值。三項營養鹽垂直變化趨勢和可培養細菌多樣性指數變化趨勢基本一致，由此推論，0 m和50 m水層微生物多樣性指數與營養鹽垂直分布呈正相關。100 m以深各項營養鹽含量基本維持不變，但受到光強減弱的影響，浮游植物光合作用能力減弱，100 m以深浮游植物生物量極低，溶解氧含量也極低。由此推論，100 m和200 m水層細菌多樣性指數還與浮游植物生物量和溶解氧相關。

2.3 南極水樣細菌系統發育分析

分離獲得的3個細菌類群中，α-變形桿菌綱為優勢類群。在 P2-8、P2-11和 P2-14，3個站位以及0、50、100和200 m的4個真光層水層中，α-變形桿菌綱均為優勢類群。這一結果與已報道的南極周邊海域浮游細菌多樣性研究結果有所差異。Zeng等［9］采用可培養方法分離培養南極普里茲灣表層水體的微生物，僅分離到γ-變形桿菌綱微生物。Giudice采用熒光原位顯微技術檢測南極周邊海域浮游細菌多樣性，研究結果表明浮游細菌主要分為5個類群：γ-變形桿菌綱（67.8%）、放線菌（16.7%）、α-變形桿菌綱（9.4%）、擬桿菌門（5.3%）和后壁菌門（0.8%）。南極周邊海域的浮游細菌中存在大量α-變形桿菌綱細菌，但非優勢類群［1］。這些研究結果的差異，可能是由于采樣季節差異、研究手段不同、以及培養過程選擇性造成的。

本研究在南極普里茲灣分離得到α-變形桿菌綱細菌57株，隸屬于13個屬（圖3），達到總菌株數量的60%。亞硫酸桿菌（Sulfitobacter sp.）在4個水層中均有分布，能氧化亞硫酸鹽提供代謝能量［10］，也有亞硫酸桿菌代謝產物的研究報道［11］。

γ-變形桿菌綱的細菌具有很強的適應性，能利用多種碳源物質進行生長［12］，它們在不同環境的生態系統中都有廣泛的分布［13］。本研究在南極普里茲灣分離得到的γ-變形桿菌綱包括交替單胞菌屬（Alteromonas），假單胞菌屬（Pseudomonas），海桿菌屬（Marinobacter）和食烷菌屬（Alcanivorax）4個屬（圖3）。其中，海桿菌屬（Marinobacter）多數為兼性好養菌，其生存范圍較為寬廣［14］，是海水中可培養的優勢細菌，在各水層均有分布。食烷菌屬（Alcanivorax）是專性降解烷烴的海洋細菌，易出現在石油污染的海洋環境。一般認為在干凈的環境中，這類專性降解菌的豐度是常規手段檢測不到的［15-17］。本文在P2-8和P2-11站位的0、100和200 m水層中均分離到了食烷菌，分別屬于已報道的2個物種。食烷菌的出現表明普里茲灣西部海水中有濃度較高的烴類存在，是否與海底油藏有一定關系尚不能明確。通過定量分析該類菌的豐度與水體中烷烴含量間的對應關系，可能得出更可信的結論。

黃桿菌是一類廣泛存在于極地低溫環境的細菌。熒光原位顯微技術表明，黃桿菌是極地海洋浮游細菌的主要類群之一［1］。不同的黃桿菌具有截然不同的生活環境和生存策略［18］，在南極生態系統中有廣泛的分布。本研究即在不同水層均分離得到黃桿菌，共計15株，分別隸屬于黃桿菌科下的8個屬（圖3），其中Croceibacter屬在各水層均有分布。

3 結論

普里茲灣真光層水體中細菌垂直分布與營養鹽和溶解氧濃度存在關聯。表層水體營養鹽濃度較低，可培養細菌Shannon多樣性指數最低，Berger-Parker優勢度指數最高；隨著深度增加，50 m水層細菌多樣性指數高于其他水層，100和200 m水層差距不明顯。普里茲灣真光層水體中細菌水平分布與浮游植物生物量和生產力水平存在關聯。P2-14位于陸架區，該站位Shannon多樣性指數和Margalef豐富度指數最高；P2-11和P2-8位于陸坡，多樣性和豐富度指數相對較低。

在微生物可培養研究過程中，應盡可能使用模擬自然條件的培養基。研究采用寡營養陳海水培養基，相比其他普通培養基，該培養基降低了營養成分濃度，與自然環境近似，從而大幅降低因營養物質充足導致生長快速菌株占據更多生態位的可能。通過這種培養方式，我們發現多個微生物新分類單元，表明南極普里茲灣真光層水體中蘊藏著大量浮游細菌資源。深入了解細菌在極地生態系統中的作用，仍需發展合適的培養方法獲取純培養菌株，并在此基礎上開展生理學等方面的研究工作。

圖3 南極普里茲灣可培養細菌16S rRNA基因系統發育樹Fig.3.Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of the strains isolated from the seawater at the Prydz Bay，Antarctic.The tree was constructed by the neighbour-joining treemethod，with Haloferaxlarsenii as the out-group.Bootstrap values are based on 1000 replicates；only values＞60%are show.Bar，0.02 substitutions per nucleotide position

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