大孔樹脂純化丹參總酚酸的研究

趙萱，傅超美，徐曉秋

·炮制制劑·

大孔樹脂純化丹參總酚酸的研究

趙萱，傅超美，徐曉秋

目的：確立大孔樹脂純化丹參總酚酸的最佳純化工藝。方法：以靜態吸附率和解吸率為考察指標，確定大孔樹脂型號，并確定純化工藝參數。結果：選擇HPD-400型號大孔樹脂用于丹參總酚酸的純化工藝，最佳吸附工藝條件為：上樣吸附流速為2BV/h，上柱液的濃度為0.5 g生藥/mL，pH值為4；解析前，以3BV的水洗脫除雜，最佳解析工藝條件為：選擇乙醇為洗脫劑，洗脫劑濃度為40%，pH值為5，控制解析流速為3BV/h。結論：所建立的方法簡便、準確，可用于丹參總酚酸的純化。

丹參總酚酸；大孔樹脂；純化工藝

大孔吸附樹脂是一類有機高聚物吸附劑。大孔吸附樹脂具有比表面積較大、交換速度較快、吸附量大、解吸和再生容易等優點，近幾年在天然產物的分離純化中被廣泛應用，本文采用大孔吸附樹脂進行分離提純處理，并對分離提純條件進行了詳細的研究。

1 材料

中江丹參(產地：四川中江，經鑒定符合《中國藥典》2010年版一部53頁“丹參”項下相關要求，購于成都西南藥都藥材市場)，原兒茶醛對照品(中國藥品生物制品檢驗所，批號810-200004)。HPD-100，HPD-200A，HPD-400，HPD-500，HPD-700樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司)，鹽酸，乙醇，甲醇，十二烷基磺酸鈉，鐵氰化鉀，三氯化鐵等試劑試藥均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備

取丹參藥材2500g，浸泡30分鐘，10倍量水，提取2次，每次提取1.5h，第一次加水時補足吸水率200%，提取液濾過，濾液濃縮至1 g生藥/mL，靜置過夜，濾過，濾液作為上樣液。

測定丹參總酚酸含量及溶液的總體積，相關的實驗數據見下表1。

表1 上樣液制備相關數據表

2.2 大孔樹脂型號的篩選[4]

選用滄州寶恩公司HPD系列大孔吸附樹脂進行試驗，以樹脂靜態吸附量、解吸率等為評價指標，對樹脂型號進行篩選。

（1）樹脂靜態吸附量的考察

稱取經預處理后的7種大孔樹脂5g（以干樹脂計）至250mL錐形瓶中，分別加入上樣液50mL，靜置24小時，濾過，以原兒茶醛為對照品，用紫外分光光度法測定濾液中丹參總酚酸的含量，計算各干樹脂的靜態吸附容量和吸附率。實驗結果見表2。

表2 各型號大孔樹脂的吸附容量

由以上靜態吸附容量實驗可見，中等極性的HPD-400樹脂以及極性樹脂HPD-500、HPD-600的吸附容量效果明顯優于其他樹脂，與丹參酚酸類物質含酚羥基屬中等極性化合物的性質一致，因而選取這三種樹脂，進一步考察其解吸率。

（2）樹脂解吸率的考察

將上述吸附飽和的大孔吸附樹脂，用水洗至水洗液無色，去除樹脂表面殘留的溶液，各樹脂分別依次用30%、50%、60%、70%、90%乙醇浸泡洗脫2次，每次10 mL、每次浸泡2h、每1h超聲振搖5min。收集各不同乙醇濃度的洗脫液。以原兒茶醛為對照品，用紫外分光光度法測定各洗脫液中丹參總酚酸剩余量和解吸量，計算解吸率。實驗結果見表3。

表3 三種HPD樹脂的吸附與解吸情況

實驗結果表明，HPD-400大孔樹脂與其余兩種樹脂相比，具有較高的的吸附量與良好的解吸率，故選擇HPD-400型號大孔樹脂用于丹參總酚酸的純化工藝研究。

2.3 大孔樹脂吸附條件的篩選

以吸附流速、上柱液濃度、上柱液酸堿度三個方面對樹脂吸附曲線的影響，確定大孔樹脂吸附純化工藝的最佳參數。

（1）上樣液濃度對樹脂吸附量的影響

取丹參靜置濾過除雜后的提取液，調節濃度分別為0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 g生藥/mL，取各濃度丹參上樣液50mL，加入預處理好的HPD-400大孔樹脂5mL，靜態吸附過夜，吸附完成后分離出上清液，以原兒茶醛為對照品，用紫外分光光度法測定剩余上清液中丹參總酚酸含量。結果見表4。

表4 上樣液濃度對樹脂吸附量的影響

結果表明，當上樣液濃度在0.5～0.7 g生藥/mL時，大孔樹脂對丹參總酚酸的吸附率較高，考慮生產成本與便于控制，確定上樣液濃度為0.5 g生藥/mL。

（2）上樣液pH值對樹脂吸附量的影響

取濃度為0.5 g生藥/mL的上樣液，調節pH值分別為2、4、6、8、10，取各pH值的丹參上樣液50mL，加入預處理好的HPD-400大孔樹脂5mL，靜態吸附過夜，吸附完成后分離出上清液，以原兒茶醛為對照品，用紫外分光光度法測定剩余上清液中丹參總酚酸含量。結果見表5。

表5 上樣液pH值對樹脂吸附量的影響

結果表明，上柱液pH值為4時，樹脂的吸附效果最佳，且符合該型號大孔樹脂使用的pH值范圍，故確定上柱液的pH值為4。

（3）吸附流速的考察

選用3根同樣的樹脂柱，量取5mL樹脂，濕法裝柱，徑高比約1: 6。取丹參上柱液（濃度0.5 g生藥/ mL，pH=4），提取液通過樹脂柱的流速分別為1BV/ h，2 BV/h，3 BV/h，室溫。分批收集流出液，每流出2BV，即2倍樹脂體積收集一份。以原兒茶醛為對照品，用紫外分光光度法測定每份流出液中丹參總酚酸的含量，計算每份流出液中丹參總酚酸的泄漏率，并對流出液的標號作樹脂動態曲線。當流出液中丹參總酚酸的泄漏率為10%時，計算此時樹脂的吸附量。

根據以上實驗結果，結合生產效率，確定上樣流速為2BV/h。

2.4 大孔樹脂洗脫條件的篩選

（1）洗脫溶劑的選擇與洗脫劑用量的確定

本實驗選用乙醇作為洗脫劑，并對乙醇濃度進行考察。

選用3根同樣的樹脂柱，量取5mL樹脂，濕法裝柱，徑高比約1:6。取丹參上柱液（濃度0.5 g生藥/mL，pH=4）以2 BV/h的流速上柱，動態吸附飽和后，分別依次用水和乙醇洗脫，控制洗脫流速為3BV/h，室溫條件下，水洗液每1BV收集一份，共收集6份，測定每份水洗脫液的總固體量，以編號為橫坐標繪制水洗脫雜質曲線。乙醇洗脫液每1BV收集一份，共收集6份，測定每份中洗脫液丹參總酚酸的量,以每份洗下的總酚酸量為縱坐標，以編號為橫坐標繪制洗脫曲線。實驗結果見表6、表7。

表6 水洗脫液的總固體量

由水洗脫曲線可知，水用量為3BV時，基本達到最大雜質洗脫量，確定水洗脫量為3BV。

選用3根同樣的樹脂柱，量取5mL樹脂，濕法裝柱，徑高比約1: 6。取丹參上柱液（濃度0.5 g生藥/ mL，pH=4）以2 BV/h的流速上柱，動態吸附飽和后，用乙醇洗脫，控制洗脫流速為3BV/h，室溫條件下，洗脫液每1BV收集一份，共收集6份，測定每份中洗脫液丹參總酚酸的量，以每份洗下的總酚酸量為縱坐標，以編號為橫坐標繪制洗脫曲線。

表7 丹參總酚酸的乙醇洗脫量

由丹參總酚酸的乙醇洗脫曲線可知，乙醇用量為4BV時，基本達到最大丹參總酚酸洗脫量。三種不同濃度的乙醇洗脫效果，以40%較好。故最終確定洗脫溶劑為40%乙醇，洗脫劑用量為4BV。

（2）洗脫劑pH值的確定

取4份己知吸附量的飽和吸附濕樹脂各5 mL，分別加入pH=4, 5, 6, 7的40%的乙醇各20mL，超聲振蕩10min后再室溫靜置12h，測定解析液中丹參總酚酸的含量，計算解析率。實驗結果見表13。

表8 洗脫劑pH值對樹脂靜態解析的影響

根據試驗結果，最終確定洗脫劑pH值為5，即洗脫溶劑為pH=5的40%乙醇。

（3）洗脫流速的確定

選用3根同樣的樹脂柱，量取5 mL樹脂，濕法裝柱，徑高比約1: 6。取丹參上柱液（濃度0.5g生藥/mL，pH=4）以2 BV/h的流速上柱，動態吸附飽和后，3BV的水以3BV/h的流速洗脫，水洗脫雜質后，以4BV 的pH=5的40%乙醇為洗脫劑，控制洗脫劑通過樹脂柱流速分別為3BV/h、4BV/h、5BV/h，室溫條件下，洗脫液每0.5 BV收集一份，測定每份洗脫液中丹參總酚酸含量，繪制樹脂動態解析曲線，比較洗脫效果，選擇最佳洗脫流速。實驗結果見表9。

表9 不同流速下丹參總酚酸的乙醇洗脫效果

根據試驗結果，流速為3BV/h時總洗脫率最高，綜合考慮解析曲線的峰值、收斂性及生產效率，確定3BV/h流速為最佳洗脫流速。

綜合以上研究，最終確定大孔樹脂純化丹參總酚酸的工藝參數為：選擇HPD-400型號大孔樹脂用于丹參總酚酸的純化工藝，最佳吸附工藝條件為：上樣吸附流速為2BV/h，上柱液的濃度為0.5 g生藥/ mL，pH值為4；解析前，以3BV的水洗脫除雜，最佳解析工藝條件為：選擇乙醇為洗脫劑，洗脫劑濃度為40%，pH值為5，控制解析流速為3BV/h，以上吸附和解析均在室溫下進行。

2.5 驗證試驗

按確定的上述工藝條件，做3次重復試驗，結果見表10。

表10 驗證試驗結果

由以上重復性實驗可知，該大孔樹脂的除雜工藝穩定可行。

3 討論

3.1 實驗中常用水提法提取丹參中總酚酸，水提取液中雜質較多，如無機鹽、蛋白質、糖、鞣質等，使得到的水提取液中丹參總酚酸的濃度較低。為了提高提取液中酚酸類物質的濃度，常采用醇提水沉淀法、吸附澄清法、高速離心法、超濾法等方法進行分離純化處理。但這些操作往往具有有效成份損失較高、生產周期長、分離處理成本高等缺點。大孔吸附樹脂具有吸附量大、解吸和再生容易等優點，現廣泛應用于中藥行業中，本文試驗結果表明，其可用于丹參總酚酸的分離純化。

3.2 樹脂洗脫試驗中，常用的洗脫劑有乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等，為減少對產品刺激性的影響及保護環境，本實驗選用乙醇作為洗脫劑，丹參總酚酸主要集中在30%乙醇洗脫液中，50%洗脫液中雖然有一定量，但總酚酸的含量明顯偏低，而70%～90%洗脫液中幾乎不含丹參總酚酸，由此可預測，乙醇的洗脫濃度范圍應在30%～50%范圍內，進而采用動態洗脫方法，確定了乙醇的最佳濃度。

[1] 李廣勝,王光新,趙牛和.丹參口服液中總酚酸性成分的含量測定[J].時珍國醫國藥,2001,12(8):683.

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[3] 李廣勝,王光新,趙牛和.丹參口服液中總酚酸性成分的含量測定[J].時針國醫國藥,2001,12(8):683.

[4] 袁海龍,李仙義,等.D-101型大孔樹脂殘留物的頂空進樣法分析研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2003,14(2):121.

（責任編輯:胡慧玲）

Purifcation of Total phenolic acid of Danshen by macroporous resin

Objective:To establish the purification technology of Total phenolic acid of Danshen by macroporous resin. Method: Static adsorption rate and desorption rate were taken as indexs to optimize the type of macroporous resin and purifcation technology parameters. Result: The HPD-400 macroporous resin was chosen in the purifcation technology of Total phenolic acid of Danshen. Optimum adsorption technological conditions were as following: The adsorption rate was 2BV/h. The concentration was 0.5 g raw drug/mL with pH of 4. 3BV water was used to elute impurity before desorption. Optimum desorption technological conditions were as following: Eluted with 40% ethanol aqueous at the fow rate 3BV/h, and pH was 5. Conclusion: The method is simple，accurate，specifc and can be applied in the purifcation of Total phenolic acid of Danshen.

Total phenolic acid of Danshen; macroporous resin; purifcation technology

R 283.6

A

1674-926X(2014)01-005-04

成都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

趙萱（1986-），女，四川德陽，碩士研究生，助教，研究方向：中藥新制劑和新劑型的研究Email:626098860@qq.com

傅超美（1961-），男，四川簡陽，教授，博導，研究方向：中藥新制劑和新劑型的研究Email:chaomeifu@126.com

2013-10-22

ZHAO Xuan, FU Chao-mei, XU Xiao-qiu//(Pharmacy College,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine;The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine;State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, China)