植物雌激素類藥物治療骨肉瘤的基礎研究進展

宋明智，張 振，王壽宇(綜述)，呂德成(審校)

(大連醫科大學附屬第一醫院骨科，遼寧 大連116021)

骨肉瘤來源于原始的成骨間充質干細胞，是成人及兒童骨組織中最常見的非血源性惡性腫瘤[1]。病灶常見于長骨干骺端毗鄰或包繞生長板處，其中約75%位于股骨遠端及脛骨近端[2-3]。該病具有發病率高、對化療抵抗[1]、預后差[3]、易向肺部轉移[4]等特點，現已成為臨床治療中的疑難疾病。目前，治療骨肉瘤的標準方法為廣泛切除原發惡變組織聯合細胞毒性化療藥物，但由于多種化療藥物具有全身毒性[5]，故使用傳統化療藥物很難達到滿意的療效。因此，人們不斷努力希望找到安全有效的抗骨肉瘤藥物。雌激素在調節青春期骨生長以及成年人骨重構的過程中發揮重要作用[6]，但腫瘤患者過量使用該化合物所產生的不良反應極多，甚至促進腫瘤生長[7]。而大量研究證實植物中含有類雌激素物質，因其具有明確的抗癌活性，且不良反應較小，故為開發新型抗骨肉瘤藥物提供了新的選擇。該文就植物雌激素治療骨肉瘤的研究成果進行綜述。

1 植物雌激素的來源與分類

植物性雌激素廣泛存在于植物中，是一種能夠結合哺乳類動物雌激素受體，并產生激動、抑制、部分激動/抑制效應[8]的非甾族化合物。植物雌激素按其分子結構可分為5類[9-11]。①異黃酮類：該類天然化合物廣泛存在于多種植物中，在大豆中含量尤為豐富。主要有金雀異黃素、大豆苷元、大豆黃素、芒柄花素、葛根素等。②黃酮：主要包括芹黃素、山奈黃素、槲皮素等，在芫花及銀杏中含量較多。③木脂素類：木脂素類存在于植物的木部和樹脂中，主要有芝麻素和厚樸酚兩種。④香豆素類：是從植物的花、莖、葉及果實中所提取的化合物，其典型代表是擬雌內酯。⑤芪類：廣泛分布于種子植物中，白蘆藜醇是研究最早也是研究最多的芪類化合物。⑥其他：α-玉米赤霉烯酮等。

2 植物雌激素治療骨肉瘤的作用機制

目前普遍認為,植物雌激素發揮抗骨肉瘤活性的結構基礎是與骨肉瘤細胞中的雌激素受體結合，影響多種信號轉導途徑及細胞代謝，進而引起細胞增殖、凋亡、分化、侵襲及遷移能力的改變[12]。

2.1對骨肉瘤細胞增殖的影響 植物雌激素抑制骨肉瘤細胞增殖已成為研究的重點。Nikitovic等[13]首次將金雀異黃素用于骨肉瘤的基礎研究中，試驗選用SAOS-2及MG-63兩種人骨肉瘤細胞系，對藥物作用后細胞外基質中特定代謝產物的濃度進行檢測，結果發現金雀異黃素能夠影響不同骨肉瘤細胞中葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAG)與蛋白聚糖(proteoglycans，PG)水平的比值變化，而GAG/PG是影響骨肉瘤增殖的關鍵因素[14]，Nikitovic等[13]認為金雀異黃素引起SAOS-2細胞GAG/PG變化的機制很可能與蛋白酪氨酸激酶系統的活化有關，而抑制MG-63細胞合成PG的機制尚不清楚。

促分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉導通路是近年來腫瘤研究最活躍的領域，大量研究顯示，腫瘤細胞的增殖變化與MAPK信號轉導密切相關。Chrzan等[15]發現,大豆苷元能有效阻止人骨肉瘤細胞系G-292產生白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)，而IL-1β已被證實可通過MAPK級聯信號轉導通路刺激骨肉瘤細胞增殖[16]。Alkhalaf等[17]采用人骨肉瘤細胞系SJSA1細胞對白蘆藜醇所引起的MAPK/p53通路變化進行研究，結果發現該化合物可誘導產生劑量依賴性生長抑制作用并降低細胞活力，這些效果在應用MAPK抑制劑PD98059后消失，由此作者推測白蘆藜醇所引起的生長抑制作用是通過調控MAPK(細胞外信號調節激酶1/2)通路及激活腫瘤抑制蛋白p53功能而實現的，該研究還發現該化合物對骨肉瘤的生長抑制作用優于T47D、MCF7、MDA-MB-231等乳腺癌細胞系。

此外，細胞周期調控異常與腫瘤發生、發展關系密切，細胞周期蛋白與細胞周期蛋白依賴性激酶結合并激活后者誘導蛋白磷酸化，促使細胞由G1期進入S期。Yokota等[18]通過試驗證實，芝麻素能夠通過蛋白酶體途徑下調包括骨肉瘤MG-63細胞中周期蛋白 D1的表達，這很有可能是其抗增殖作用的機制之一。還有報道稱白蘆藜醇參與了U-2OS細胞的DNA修復和細胞周期調控，試驗結果顯示白蘆藜醇上調了U-2OS細胞中乳腺癌易患基因1及端粒蛋白的表達，誘導端粒穩定性發生變化，同時激活DNA損傷信號，進而發揮抑增殖作用[19]。

2.2對骨肉瘤細胞凋亡的影響 植物雌激素可通過多種不同途徑誘導骨肉瘤細胞凋亡。金雀異黃素及大豆黃素處理轉染雌激素受體的U-2OS細胞時，可將細胞周期阻滯于S期，并通過啟動凋亡程序顯著降低細胞生存率，這可能與植物雌激素誘導表皮生長因子受體下調有關[6]。Huang等[20]的最新研究顯示，山奈黃素具有低細胞毒性，對多種骨肉瘤細胞系具有明顯的促凋亡作用，尤其是對U-2OS細胞的療效具有劑量依賴性。該研究還發現，經治療后細胞核中DNA斷裂、胞質Ca2+水平增高、線粒體膜電位下降、時間依賴性蛋白質的表達受到影響。Huang等[20]認為，山奈黃素的抗骨肉瘤活性很可能與內質網應激通路及線粒體信號轉導通路有關。Lin等[21]證實了芹黃素對骨肉瘤的療效，并提出芹黃素引起細胞凋亡的外源性信號轉導通路，他們發現芹黃素可激活胱天蛋白酶-3、-8、-9及Bax并釋放凋亡誘導因子，引發線粒體功能障礙，從而降低U-2OS細胞的存活率。Liu等[22]對不同濃度治療組中的生存素及p21cip1/WAFI蛋白表達及相應mRNA進行檢測，結果顯示白蘆藜醇很可能通過調節生存素及p21cip1/WAFI的表達變化，從而發揮對MG-63細胞的生長抑制及誘導凋亡作用。

2.3對骨肉瘤細胞分化的影響 隨著研究的不斷深入，也有學者將植物雌激素促骨肉瘤細胞分化作為研究的切入點[23]。有報道稱，金雀異黃素能夠誘導小鼠骨肉瘤細胞系LM8發生分化[23]。研究人員對各組細胞進行蘇木精-伊紅染色及反轉錄-聚合酶鏈反應檢測，發現經金雀異黃素處理后的LM8細胞形態發生明顯變化，同時，治療組骨鈣蛋白mRNA表達水平顯著增高[23]。金雀異黃素還可促使細胞合成大量的膠原蛋白、堿性磷酸酶及形成礦化小結，以誘導MG-63細胞的分化[9]。Salvatori等[6]認為金雀異黃素及大豆黃素作用轉染雌激素受體的U-2OS細胞后，通過激發表皮生長因子受體信號轉導途徑，上調骨唾液蛋白及骨鈣蛋白的表達，促使其向成骨細胞分化。

2.4對骨肉瘤細胞的侵襲及遷移能力的影響 侵襲及轉移能力常作為衡量骨肉瘤惡性程度的重要標準，同樣引起了研究人員的關注。植物雌激素很有可能通過改變特定蛋白表達水平以影響骨肉瘤細胞侵襲及遷移能力。Nakamura等[23]發現，經金雀異黃素治療的鼠骨肉瘤LM8細胞表達及分泌的基質金屬蛋白酶2少于對照組，鈣緊張素的分布情況也有明顯變化，對照組細胞中鈣緊張素出現在胞質及細胞核處，而治療組細胞的鈣緊張素表達量更高并易位至近質膜處。經大豆苷元處理的骨肉瘤G-292細胞能有效阻止細胞因子IL-6的分泌[15]，當前研究認為IL-6能夠激活信號轉導與轉錄激活因子3通路促進骨肉瘤細胞的遷移[24]。擬雌內酯亦能夠抑制骨肉瘤細胞IL-6促進子的活性，并具有劑量依賴性。Steinmann等[25]的研究證實厚樸酚能有效阻止骨肉瘤細胞遷移，該試驗結果顯示，小鼠骨肉瘤細胞系LM8-lacZ在厚樸酚濃度達5000～10000 μg/L時，遷移強度隨藥物濃度變化呈劑量依賴性，當藥物濃度達15000 μg/L時，該細胞遷移的活動基本終止。

2.5其他 為解決長期使用傳統化療藥物所導致的藥物抵抗及減少藥物劑量問題，研究人員將安全有效的植物雌激素與化療藥物聯用，獲得了較好的效果。Zhang等[26]將金雀異黃素與常規化療藥物吉西他濱聯合應用對MG-63及U-2OS兩種骨肉瘤細胞系進行體外試驗，結果顯示金雀異黃素能夠增強吉西他濱誘導的骨肉瘤細胞凋亡過程，研究發現吉西他濱僅能夠通過激活核因子κB通路發揮抗癌活性，故易引起藥物抵抗。而金雀異黃素具有抑制核因子κB通路及阻滯蛋白激酶B信號轉導通路的生物活性[27]，可以扭轉吉西他濱造成的由頭段開始的藥物抵抗。Liang等[28]的最新研究顯示，對MNNG/HOS骨肉瘤細胞系進行的體內、外試驗得到了相同的結論，金雀異黃素能夠通過抑制蛋白激酶B/激活核因子κB信號轉導通路，以增強吉西他濱的誘導凋亡作用，更加驗證了金雀異黃素與吉西他濱聯合應用有望成為一種既合理又有效的化療方法。

亦有研究對植物雌激素類衍生物的抗骨肉瘤能力進行了探索。人工合成的3′,4′-二氯-3-(3,4-二氯苯乙酰)-2,4,6-三羥基脫氧安息香是異黃酮類衍生物，可以誘導多種骨肉瘤細胞凋亡，其作用機制與激活活性氧-凋亡信號調節激酶1-絲裂原活化的蛋白激酶激酶-3/6-p38信號通路有關[29]。另一種新型異黃酮衍生物7-羥基-3′,4′-苯并異黃酮亦可引起活性氧-凋亡信號調節激酶1-絲裂原活化的蛋白激酶激酶-3/6-p38信號級聯反應放大，促進骨肉瘤細胞系U-2OS中p53活化及Bax表達，從而發揮抗骨肉瘤作用[30]。

3 展 望

植物雌激素類藥物在治療骨肉瘤方面的優勢已嶄露頭角，并引起了該領域研究者的廣泛關注。雖然目前對于植物雌激素治療骨肉瘤的研究多以體外試驗為主，且研究的重心主要在于探討不同植物雌激素發揮抗骨肉瘤作用的可能機制，但不可否認該領域極具科研潛力，還有很多問題亟需研究解決，如多種植物粗提取物已被證實具有抗骨肉瘤活性，成分中是否存在未知的植物雌激素；除雌激素受體外，骨肉瘤細胞中是否存在其他能夠與植物雌激素結合的受體；部分植物雌激素抗癌具有雙向調節作用，如何確定濃度臨界點有待探討；能否對該類化合物結構進行改造，使其更有利于發揮抗骨肉瘤作用；多種植物雌激素聯合治療骨肉瘤效果如何。此外，與常規化療藥物相比，該類化合物的抗骨肉瘤效果稍弱，但其來源廣泛、安全、無毒、無不良反應、可與化療藥物聯用、不易產生耐藥，更符合現代醫學發展規律，具有極強的臨床推廣及應用價值。

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