石油烴污染土壤中腐植酸對草本植物吸收重金屬的影響

Soyoung Park，Ki Seob Kim，Daesok Kang，Hansam Yoon，Kijune Sung 著 陳昊 林啟美* 譯

(1 釜慶國立大學海洋產業發展研究中心 釜山 6120222 釜慶國立大學生態工程系 釜山 6120223 中國農業大學資源與環境學院土壤和水科學系 北京 100093)

石油烴污染土壤中腐植酸對草本植物吸收重金屬的影響

Soyoung Park1，Ki Seob Kim2，Daesok Kang2，Hansam Yoon1，Kijune Sung2著 陳昊3林啟美3*譯

(1 釜慶國立大學海洋產業發展研究中心 釜山 6120222 釜慶國立大學生態工程系 釜山 6120223 中國農業大學資源與環境學院土壤和水科學系 北京 100093)

本文研究了重金屬和石油烴復合污染土壤中，腐植酸對草本植物吸收重金屬的影響。結果顯示：腐植酸大幅度地降低了污染土壤中可溶性和交換態重金屬含量，但提高了植物可利用態重金屬含量。土壤添加腐植酸后，除Ni外，重金屬潛在生物有效性和可淋出性因子大于1，這表明大多數重金屬對植物具有潛在的有效性。此外，腐植酸增加了鉛(Pb)、銅(Cu)、鎘(Cd)和鎳(Ni)在供試植物幼苗和根部的積累，最高的是高羊茅幼苗，達264.7%，生物富集系數從0.30提高到1.10。蕓苔根中Ni和Pb的生物富集系數也有所提高。這些研究結果表明，石油烴與重金屬同時污染的情況下，加入腐植酸可以促進植物吸收重金屬，但降低重金屬淋失，防止地下污染。

植物萃取 植物有效性 生物富集系數(BCF)轉移系數(TF)生物有效性和可淋出性因子(BLF)

全球工業化和城市化地區的土壤中，重金屬濃度均增加，生態和人類健康的風險相應提高，急需研發多種清潔技術并推廣應用。植物修復重金屬污染土壤，被認為是一個成本低且環保的方法。雖然大多數植物都具有吸收重金屬的能力，但只有能夠在高濃度重金屬污染土壤中生長的植物，才可以被用于修復重金屬污染土壤。如果這些植物生物量很高，就會吸收比較多的重金屬，修復效果會很好。然而，重金屬有效性是限制植物吸收的一個重要因素，即使植物可以吸收重金屬，但若有效態濃度很低，植物吸收也很少，修復效果就很差。因此，污染土壤中的重金屬能否被植物成功萃取，取決于重金屬生物有效性。

在植物修復中，螯合劑曾被用來提高重金屬的生物有效性。然而，類似乙二胺四乙酸(EDTA)與重金屬的螯合物，對土壤微生物和植物都有毒害性，阻礙植物生長，而且這些螯合物的生物降解性差，易殘留在土壤中。因此，無毒的且可生物降解的螯合劑，如乙二胺-N、N’-琥珀酸酯和次氮基三乙酸，是EDTA良好的替代制劑。但是，其螯合過程中也存在重金屬淋出的風險。

腐殖質是天然的螯合劑，是土壤有機質的主要組分，是由有機物質再合成形成的大分子物質組成的混合物。作為腐殖質的組成部分，腐植酸(HA)是一種從土壤中提取的暗色有機物質，不溶于稀酸。因為腐殖質可以改善土壤物理、化學性質，提高土壤肥力，因此，在重金屬污染甚至重金屬與石油烴復合污染的土壤中，也能夠促進植物生長。腐殖質含有多種活性且相互作用的官能團，如羧基和酚羥基等，與重金屬通過絡合作用，影響重金屬在土壤和水中的固持能力和移動性。Halim等(2003)研究發現，在富含重金屬的土壤中添加腐植酸，雖降低了可提取態重金屬含量，但提高了植物可利用態含量。Evangelou等(2004)也報道，盡管植物可利用態鎘的濃度沒有顯著變化，但腐植酸提高了煙草SR-1對鎘的吸收。

土壤如果遭受有機化合物和重金屬雙重污染，難以利用生物進行修復，因為重金屬抑制有機物質降解。但這種污染時有發生，且在土地利用方式改變后，這些污染物通常暴露在外。因此，需要降低污染物濃度至比較低的水平，從而使微生物可以有效地降解有機污染物。由于腐殖質能夠促進植物生長，改善礦質營養，因此，也應能促進植物萃取重金屬；重金屬濃度降低，反過來又會促進微生物降解有機污染物。此外，腐植酸還可以通過為根際微生物提供有利的條件，增強對有機污染物的降解能力。

關于腐植酸對土壤中重金屬有效性的影響已有一些研究，并且有些研究成果已經應用到復合污染土壤的重金屬植物萃取，但重金屬與石油烴雙重污染的研究很少。本研究利用石油烴與重金屬雙重污染土壤，研究腐植酸在提高一系列重金屬(如鎘、銅、鉛和鎳等)的植物有效性以及植物生長方面的作用，同時檢測了腐植酸對三種草本植物吸收重金屬的影響。

1 材料與方法

1.1 植物的選擇及試驗設計

選擇蕓苔、高羊茅和向日葵3種植物作為供試植物。污染土壤人為配制，Pb(400mg/kg)，Cu(200mg/kg)，Cd(12 mg/kg)，Ni(160mg/kg)，總石油烴(TPHs; 2000mg/kg)。首先，將蕓苔、高羊茅和向日葵置于人工生長箱中，在未污染土壤中生長2周，再從中選擇四株長勢良好的植株，移植到裝有污染土壤的不銹鋼盆中(高14.5 cm，內徑10.5 cm)。溫室生長60d，白晝14 h，光強3500±800lux，濕度45%～50%，溫度28±2 ℃，每盆每天澆蒸餾水50mL，每5 d檢測植物莖的長度。

為了評估重金屬和石油烴復合污染土壤中，腐植酸對植物吸收重金屬的影響，試驗設8個處理，隨機區組排列，不設重復。試驗處理分別為：(1)污染土壤對照(1個盆)；(2)污染土壤+腐植酸(1個盆)；(3)污染土壤分別種植3種不同植物(3個盆)；(4)污染土壤+腐植酸分別種植3種植物(3個盆)，每盆裝土1 kg。

1.2 土壤處理

土壤采自韓國釜山釜慶國立大學校園內，自然風干后過2 mm篩。加入PbCl2(99%，Kanto，日本)、CuCl2(99%，Acros，比利時)、CdCl2·2.5H2O(98%，Kanto，日本)和NiSO4·6H2O(99%，Kanto，日本)，最終使土壤中Pb含量達400mg/kg，Cu含量達200mg/kg，Cd含量達12 mg/kg，Ni含量達160mg/kg。同時，加入市購的柴油(TPH)，76%的直鏈和支鏈烷烴以及24%的芳香鏈烷烴(烷基苯，環烷基苯，烷基萘和多環芳烴)組成，TPH濃度為2300mg/kg。本研究通過分析正辛烷(C8)到正二十八烷(C28)中的碳氫化合物含量，來量化柴油中的石油烴濃度。

實驗在室溫下保持7 d使其穩定后，再按0.1%(w/w)比例加入市售的腐植酸(D a es i n公司，韓國)，腐植酸的元素組成為C(73.1±2.5%)，H(6.2±0.3%)，N(0.7±0.2%)和S(1.2±0.01%)。

土壤理化性質如下：pH值7.71(pH電位計，土水重量/體積比為1:1)，有機質含量3.82%(直接灼燒法)。陽離子交換量19.14 coml/kg采用1 N醋酸銨置換法測定。土壤C、N、S含量分別為17.7±1.8%，6.0±0.7%，12.3±1.1%，用德國元素分析儀測定。沙粒、粉粒和粘粒用吸管法測定，分別為77.2%、8.2%和14.6%，根據美國農業部質地分類法為沙壤土。土壤浸出液的Pb、Cu、Cd和Ni均采用HNO3-H2O2消化ICP-AES測定(美國環境署3050B)，結果分別為33.8 mg/kg、59.6 mg/kg、1.4 mg/kg和14.16 mg/kg。

1.3 土壤分析

分別于試驗開始后的第15 d、30d、60d，采集根際土壤，測定易溶、可交換態和植物有效態重金屬含量。由于土壤中重金屬以多種形態存在，因此采用不同的提取劑。易溶和可交換態重金屬(RSEM)：稱取5 g土壤樣品于錐形瓶中，加入50mL 2.5%(v/v)冰醋酸溶液，震蕩2 h。植物有效態重金屬(PAM)采用二乙烯三胺五乙酸(DPTA)提取法。稱取5 g土壤于錐形瓶中，加入10mL含有0.005 M DTPA、0.01 N CaCl2和0.1 M 三乙醇胺的混合溶液，用1 M HCl調節pH值到7.3，震蕩2 h。懸浮液在真空條件下用Whatman NO.41濾紙過濾，上清液中RSEM和PAM濃度用原子吸收光譜法檢測(Perkin Elmer，美國)。

生物有效性和可淋出性因子(bioavailability and leachability factor，BLF)作為一個新的無量綱因子，可簡單地表示重金屬形態的有效性，以及在土壤中的運移特性。

根據下式計算BLF：

公式中，CPAM和CRSEM分別為PAM和RSEM的濃度(mg/kg dw)，當CRSEM比CPAM大時，BLF值小于1，說明更多的重金屬可以從系統中淋洗出來。如果BLF大于1，則更多的重金屬為植物可利用態，植物可以從土壤中吸收更多的重金屬。BLF還可以更清晰地解釋添加腐植酸對重金屬形態的改變以及對植物修復潛力的影響。

1.4 重金屬在植物體內的累積

培養60d后，收割植物，用去離子水洗去根上的土壤。用HNO3-H2O2消化ICP-AES(Perkin Elmer, 美國)測定重金屬濃度。

生物富集系數(bioconcentration factor，BCF)用以評價重金屬在植物中的積累。

根據下式計算BCF：

公式中，C植物和C土壤分別為植物和土壤中重金屬濃度(mg/kg 干物質)。

轉移系數(translocation factor，TF)用以比較重金屬在植物組織內的分布以及從根部向莖部的遷移。

根據下式計算TF：

公式中，C莖和C根分別表示植物根和莖中重金屬的濃度(mg/kg 干物質)。

1.5 數據分析

對于可影響污染土壤中重金屬歸宿的3個因素(腐植酸、種植植物、時間)，采用方差分析(ANOVA)和最小顯著差法(LSD)(SAS 9.1)進行統計檢驗，CPAM和CRSEM比較分析采用單因素方差分析和Duncan多重比較法檢驗差異。

2 結果與討論

2.1 對植物生長的影響

4種不同土壤條件中蕓苔、高羊茅和向日葵的莖長度變化如圖1所示。除蕓苔早期生長迅速，其余植物莖的增長率可以用線性方程表示。所有方程的吻合較好，R2決定系數較高(圖1）。

當重金屬和石油烴兩種污染物同時存在時，植物生長受到了明顯的抑制，其中對高羊茅影響最大，對向日葵的影響最小。所有植物莖增長率：未污染土壤添加腐植酸>未污染土壤>污染土壤添加腐植酸>污染土壤。無論是污染土壤還是未污染土壤，添加腐植酸均起到了積極的作用。添加腐植酸降低了污染物對向日葵生長的抑制作用，說明在重金屬和石油烴復合污染的土壤中，腐植酸可以促進植物生長。

圖1 4種土壤條件下3種植物60天培養期間莖長的變化Fig.1 Shoot length over 60days in four soil conditions

2.2 易溶態和可交換態重金屬(RSEM)

不同處理土壤中RSEM的濃度不同(圖2)。添加腐植酸降低了RSEM濃度(P<0.001，表1)。顯然，重金屬的溶解度和可淋出性降低，這可能是由于腐植酸與重金屬形成了穩定的絡合物。這與腐植酸含有較多的含氧官能團，如各種類型的羧基、苯酚、羥基和羰基等有關，添加腐植酸明顯地提高了土壤結合重金屬離子的能力。

圖2 添加和不添加腐植酸的污染土壤種植不同植物15、30、60天后土壤CRSEM值Fig.2 Concentrations of readily soluble and exchangeable heavy metals recovered from arti fi cially contaminated soil, depending on humic acid(HA)treatment and plant species, 15, 30, 60days after the initiation of the experiment

表1 不同處理對土壤水溶性鈣含量的影響Tab.1 Effects of different treatments on soil water soluble-Ca content

60d試驗結束時，所有處理的RSEM值都降低，這可能與淋洗及老化有關。如C u、H A對RSEM的影響在第15天比第60天大很多，說明腐植酸對Cu的影響持續時間不長。Halimet等(2003)的研究顯示，在富含有機質的土壤中(2.7%)，Cd、Cu、Ni、Pb和Zn在醋酸中的溶解度，隨著培養時間的延長而降低；而在有機質含量較低的土壤中(0.8%)，Cd和Zn在醋酸中的溶解度，在30d和60d沒有發生變化，這表明土壤有機質的含量影響土壤RSEM值的變化。本試驗供試土壤有機質含量較高，達到3.82%，顯然對RSEM產生影響。

比較添加與未添加腐植酸的土壤中4種重金屬提取量，可以由此評估腐植酸對RSEM濃度的影響(圖3)。與不添加腐植酸相比較，添加腐植酸后導致土壤中Pb、Cu、Cd和Ni的RSEM濃度分別降低了31.2%、8.9%、18.6%和25.3%。種植植物后，添加了腐植酸土壤中Pb、Cu、Cd和Ni的CRSEM與不添加腐植酸相比較，分別減少了24.4%～35.2%、10.1%～13.4%、9.5%～25.2%和27.7%～28.9%。顯然，腐植酸對CRSEM的影響因重金屬類型而異。從圖3可以看出，在60d試驗結束時，Pb和Ni降低的幅度最大，而Cd和Cu則最小(P<0.001)。但是，種植植物并不會顯著地影響HA的這種效應。

添加腐植酸后，土壤酸度從pH值7.71升高到pH值8.18，但60d后，土壤pH值降低至7.67～7.88。Vallini等(1993)研究結果顯示，添加腐植酸后，土壤酸度從pH值8.1～8.2升高到pH值8.7，繼續添加腐植酸，土壤pH值還會提高。Hanafi和Salwa(1998)的研究結果顯示，當土壤pH值高于腐植酸pH值時，添加腐植酸會降低土壤pH值。重金屬溶解度在很大程度上取決于pH值，但供試土壤近于中性，因此，pH值對重金屬溶解度的影響可以忽略。

圖3 添加腐植酸并種植不同植物60天后土壤四種重金屬RSEM和PAM的變化率Fig.3 Changes in readily soluble and exchangeable metals (RSEM)and plantavailable forms of heavy metals(PAM)in humic acid(HA)-treated pots in comparison with the control pot without both HA amendment and plants at the end of the 60-day experiment

2.3 植物有效態金屬(PAM)

重金屬的植物有效性可用PAM表示。與CRSEM相反，添加腐植酸提高了所有處理CPAM(圖4)。無論添加腐植酸與否，所有處理CPAM在培養60d期間都在變化(P<0.01，表1)，但在30d后，種植植物與未種植植物的土壤存在明顯的差異。對照處理在60d期間重金屬植物有效性穩定下降，但種植植物土壤無論添加腐植酸與否，重金屬植物有效性在30d內上升之后下降，這可能是因為植物阻礙了重金屬在土壤中的淋洗，隨后被植物吸收所致。

圖 4 重金屬污染土壤各處理培養第15、30、60天土壤重金屬植物有效態含量Fig.4 Concentrations of the phytoavailable forms of heavy metals recovered from the soil contaminated with heavy metals at 15, 30, and 60days of incubation

腐植酸對各種重金屬的CPAM均有顯著的影響(P<0.001，表1)，對Cu和Ni的影響最大，其次是Cd和Pb。不種植植物時，添加腐植酸處理Pb、Cu、Cd和Ni的CPAM分別比對照增加了20.9%、148.6%、34.4%和223.7%(圖2)，顯然，Cu和Ni的增加量大于Cd和Pb(P<0.001)。BLFs值為土壤中各種重金屬潛在生物有效性與可淋出性的比值，用以評估腐植酸增強植物修復的潛力。圖5的結果表明，腐植酸提高了4種重金屬的BLFs值分別為：Cu 167.2%～224.7%、Ni 92.7%～107.6%、Cd 65.8%～98.4%、Pb 49.1%～86.9%。很顯然，腐植酸對Cu和Cd的影響最大，且大于1。比較圖3的結果，不難發現Cu的BLF提高是由于CPAM增加所致。但對于Ni，其BLF的增加是由于CRSEM的降低和CPAM的提高。腐植酸加入到土壤后，4種重金屬BLFs順序為：Pb>Cu>Cd>Ni。BLFs的提高表征重金屬植物萃取潛力增強，盡管Ni的BLF小于1，但也不排除部分Ni被植物吸收的可能性，因為植物種類、土壤性質及重金屬絕對濃度等均會影響重金屬的植物萃取。

2.4 腐植酸對植物吸收重金屬的影響

不同植物根和莖中的重金屬濃度不同，見圖6。總體來看，根中的濃度大于莖，添加腐植酸提高了根和莖中的重金屬濃度，但變化幅度存在差異。供試的3種植物對4種重金屬的吸附試驗結果顯示，蕓苔對Cu的吸收能力最強。

BCFs可以指示植物對重金屬積累的程度。結果顯示，添加腐植酸提高了所有重金屬和植物的BCFs，但無論添加腐植酸與否，根部BCFs均高于莖。例外的是，Cu在蕓苔中更容易從根部運輸到莖。所有植物的根和莖中，Cd的BCFs最高，而Pb則最低。顯然，植物對重金屬的吸收不僅僅依賴BLFs，不管是否添加腐植酸，蕓苔和高羊茅處理的BCFs均高于向日葵。

從表2中可以看出，高羊茅中莖C u的B C F從0.261提高到0.950，提高了264.7%，幅度最大。添加腐植酸，蕓苔根部Ni的BCF從0.781提高到1.797，提高了130.0%，Pb從0.697提高到1.360，提高了95.1%，向日葵莖對Cd的吸收增加了0.7%。然而，在水體環境，由于水生植物吸收腐植酸，添加腐植酸顯著降低了水生植物重金屬含量。一些研究結果顯示，添加腐植酸可以降低苦草中Cu和Cd的濃度，減少金魚藻對Cd和Zn的累積，也會使浮萍對Pb的積累降低。可見，在水生與陸地生態系統中，腐植酸對植物吸收重金屬的影響機制可能存在差異。

圖5 各處理第60天重金屬PAM和RSEM的比值(BLF)Fig.5 Ratios of the plant available (PAM)to the readily soluble and exchangeable forms(RSEM)of heavy metals (BLF)at day 60of the experiment

圖6 培養60天各類植物根和莖中的重金屬濃度Fig.6 Heavy metal concentrations inashoots and broots of the plant species tested at the end of the 60-day experiment

表2 60天培養結束后4種重金屬的生物富集系數(BCF)和轉移系數(TF)Tab.2 Bioconcentration factors (BCF)for the shoots and roots and translocation factors (TF)for four heavy metals at the end of the 60-day experiment

TF值因植物和重金屬種類不同而異，高TF值表示更多的重金屬從根部運輸到莖，反之，植物吸收的重金屬則更多地滯留根部。高TF值的重金屬，可以通過收獲莖，將污染從土壤中去除。添加腐植酸后TF的變化如圖7所示。添加腐植酸促進Cd從蕓苔根部運輸到莖，幅度達51.5%，高羊茅中的Cu也提高了119.6%(圖7、表2)。除蕓苔中的Cu外，所有植物4種重金屬的TFs均小于1。但是，TF值僅表征根與莖的重金屬濃度比率，其值減小并不表示植物吸收重金屬量減少。如果C莖的增加量小于C根，TF值也可能降低。因此，TF值和濃度應同時考慮，從而定量評價重金屬在植物體內運輸。莖中的TF和BCF值升高，說明腐植酸對重金屬污染土壤中的植物修復起一定作用。

圖7 60天培養結束時4種重金屬在植物根莖間轉移系數(TFs)Fig.7 Translocation factors (TFs)of the tested plants at the end of the 60-day experiment

3 結論

本研究采用人工添加重金屬(Cd、Cu、Pb、Ni)的方法模擬重金屬污染土壤，研究腐植酸對土壤重金屬植物萃取的影響。結果顯示，所有處理中腐植酸均降低了RSEM值，提高了PAM值，這表明通過添加腐植酸可降低土壤中重金屬淋淋洗的風險。但是，盡管腐植酸可以降低土壤CRSEM，原位施用腐植酸作為螯合劑，但由于重金屬的淋出，可能會造成地下水污染。因此，需采用明確的預防措施，如制定嚴格的檢測方案。此外，添加腐植酸可提高重金屬的生物有效性，BLFs值作為可反應土壤中重金屬的生物有效性和可淋出性的指標，添加腐植酸后提高至大于1，而Ni是唯一的例外，這意味著更多的重金屬可成為植物可吸收的形態。污染土壤添加腐植酸，所有重金屬和植物的BCFs值均高于不添加腐植酸處理，顯然，重金屬污染土壤中添加腐植酸，提高了三種植物吸收累積重金屬。本研究結果揭示了在石油烴和重金屬復合污染土壤中，可通過施用腐植酸來提高植物萃取一系列重金屬(如Cd、Cu、Pb和Ni)的能力。

致謝和參考文獻(略)

譯自：Environ Earth Sci，2013，68：2375～2384。

Effects of Humic Acid on Heavy Metal Uptake by Herbaceous Plants in Soils Simultaneously Contaminated by Petroleum Hydrocarbons

Soyoung Park1, Ki Seob Kim2, Daesok Kang2, Hansam Yoon1, Kijune Sung2write Chen Hao3, Lin Qimei3*translate
(1 Research Center for Ocean Industrial Development,Pukyong National University, Busan, 6120222 Department of Ecological Engineering,Pukyong National University, Busan, 6120223 Department of Soil and Water Sciences, College of Resources and Environmental Sciences,China Agricultural University, Beijing, 100093)

The effects of humic acid (HA)on heavy metal uptake by herbaceous plants in soil simultaneously contaminated with heavy metals and petroleum hydrocarbons were investigated. The results showed that HA reduced readily soluble and exchangeable forms of heavy metals in the contaminated soil but increased their plant-available forms. Potential bioavailability and leachability factors became larger than 1 after adding HA to the soil, except for those of Ni,suggesting that more heavy metals could be potentially phytoavailable for plant uptake. Furthermore, HA increased the accumulation of Pb, Cu, Cd, and Ni in the shoots and roots of selected plants. The greatest increase in the accumulation of heavy metals was 264.7% in the shoot of Festuca arundinacea, with the bioconcentration factor (BCF)increasing from 0.30to 1.10. Humic acid also increased the BCFs of the roots of Brassica campestrisfor Ni and Pb. These results suggest that HA amendment could enhance plant uptake of heavy metals, while concurrently reducing heavy metal leachability and preventing subsurface contamination, even in soils simultaneously contaminated with petroleum hydrocarbons.

phytoextraction; phytoavailability; bioconcentration factor(BCF); translocation factor(TF); bioavailability and leachability factor(BLF)?

TQ314.1，S156.99

A

1671-9212(2014)03-0028-09

2013-11-05

陳昊，男，1988年生，中國農業大學在讀博士研究生。主要從事土壤生物與生物過程的研究。*通訊聯系人：林啟美，男，教授。 E-mail:linqm@cau.edu.cn。