縫隙連接抑制劑辛醇對大鼠局灶性腦梗死后MDA 和SOD 的雙向作用

曾維勇，丁文婷，邱 敏，劉 微

缺血性腦血管疾病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是對人體健康具有嚴重危害性的多發病與常見病。ICVD 的損傷機制涉及到興奮性氨基酸毒性、細胞內鈣超載、細胞凋亡等。其中，位于星型膠質細胞膜上的縫隙連接(gap junction，GJ)是細胞間物質與信息傳遞的通路，在腦缺血中半暗帶(ischemic penumbra，IP)向梗死灶的發展過程中有雙向作用［1～3］，但其雙向作用機制尚不明確。

有研究指出，縫隙連接抑制劑辛醇對局灶性腦缺血再灌注損傷存在雙向作用，且可能與腦缺血時間有關［4，5］。制作局灶性腦缺血再灌注模型前給予辛醇抑制縫隙連接，通過檢測不同程度腦缺血腦組織中過氧化物歧化酶(SOD)與丙二醛(MDA)的含量，來探討論證縫隙連接抑制劑辛醇在腦缺血中的雙向作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料 清潔級雄性SD 大鼠80 只，體重180～220g，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，動物許可證編號SCXK(粵)20130020。動物飼料由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。辛醇(購自美國SIGMA-ALDRICH 公司)，溶于0.5%的二甲基亞砜(DMSO)(購自美國AMRESCO 公司)溶液。SOD、MDA 及蛋白定量試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器 電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)、低溫離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)、紫外分光光度計(Biochrom Ltd)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 SD 只大鼠隨機分為假手術組、同一時間點的模型組和辛醇組，每組16 只。根據前期實驗結果［4，5］，在缺血后30 min 及2 h 再灌注損傷明顯不同，所以選擇這2 個缺血時間，即30 min 和2 h 進行辛醇干預。

1.2.2 給藥及制備模型 辛醇組于缺血前30 min 按5 mmol/kg 的劑量腹腔給藥。腦缺血模型組予以等量的DMSO溶液替代。采用改良的Longa 線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。大鼠腹腔內注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，仰臥固定，頸部正中切口，分離并暴露右側頸總及頸內、外動脈，并在頸內、外動脈分叉處結扎頸外動脈，右側頸總動脈剪口，插入頭端燒成圓鈍形直徑為0.26 mm 的尼龍魚線，進線長度18 mm～19 mm，缺血相應時間(30 min/2 h)拔出線栓。剔除實驗期間死亡及模型不成功的大鼠，并及時予以補充。再灌注24 h 后，腹腔麻醉大鼠，迅速斷頭取腦，用冰冷生理鹽水漂洗干凈后，除去軟腦膜，取缺血大腦半球約300 mg的額、頂葉腦皮質(電子天平稱重)，-80 ℃冰箱中冷藏待用。

1.2.3 腦組織勻漿生化指標檢測 將腦組織加入9 倍于樣品重量的生理鹽水，在冰水浴中勻漿制成10%(W/V)的組織勻漿液。置于低溫離心機中，以3500 r/min 的轉速在4 ℃下離心10 min。取上清液，嚴格按照說明書要求測定腦組織勻漿中的蛋白濃度、MDA 和SOD 含量。

1.2.4 統計學分析 實驗數據采用SPSS19.0 for Windows 軟件包統計，各組資料結果均以均數±標準差(±s)表示。樣本均數的比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示具有顯著性差異，P＜0.01 表示具有非常顯著性差異。

2 結果

2.1 各組MDA 含量的比較 同假手術組相比，缺血30 min和2 h 的模型組腦缺血組織中的MDA 含量均明顯升高(P＜0.05)，而且2 h 模型組比30 min 模型組含量更高。缺血30 min 的辛醇組，大鼠腦缺血組織中的MDA 含量明顯高于30 min 模型組(P＜0.05)。然而，缺血2 h 的辛醇組大鼠腦缺血組織中的MDA 含量明顯低于2 h 模型組(P＜0.05)(見表1)。

表1 辛醇對大鼠腦組織勻漿中MDA 和SOD 含量的影響

2.2 各組SOD 含量的比較 同假手術組相比，缺血30 min和2 h 的模型組腦缺血組織中的SOD 含量均明顯降低(P＜0.05)，而且2 h 模型組比30 min 模型組含量更低。缺血30 min 的辛醇組，大鼠腦缺血組織中的SOD 含量顯著低于30 min 模型組(P＜0.05)。與此相反的是，缺血2 h 的辛醇組大鼠腦缺血組織中的MDA 含量明顯高于2 h 模型組(P＜0.05)(見表1)。

3 討論

目前腦缺血的治療主要包括兩個方面:一方面是改善和恢復缺血區的血液供應，促進微循環;另一方面是使用腦細胞保護劑進行綜合治療，包括鈣離子通道阻滯劑、自由基清除劑和興奮性氨基酸拮抗劑等。然而，目前這些治療方法的效果不是很理想。近年來大量的實驗研究和臨床動態觀察表明，腦缺血的損傷是進行性的，缺血中心區細胞先發生死亡，繼而位于缺血中心區周圍、血供相對減少的區域半暗帶的細胞逐漸失去活性，梗死范圍擴大。但是如果及時給予適當的治療挽救這些細胞，就會減小梗死體積改善預后。因此拯救位于半暗帶的神經元成為治療腦缺血的關鍵［6，7］。大量實驗表明半暗帶神經元的死亡不是局部血流量的減少或缺失直接造成的，它屬于繼發性損傷:缺血區域的擴散性神經電活動和細胞內鈣超載、過量的興奮性氨基酸和自由基，最終造成細胞膜的破壞和神經元的死亡，使半暗帶轉變為不可逆性損傷的腦組織。

星形膠質細胞通過提供葡萄糖、重吸收谷氨酸、釋放營養因子等對神經元起著重要的支持作用［8］。位于其細胞膜上的縫隙連接是星形膠質細胞中最具有特色的結構，由大量連接小體(主要是connexin 43)有規律排列構成。它允許直徑＜1.5 nm 的小分子物質通過，為細胞間物質和信息的傳遞提供了直接通路［1］。有研究表明縫隙連接抑制劑辛醇可擴大腦缺血30 min 的梗死體積并加重其神經元損傷，卻減少腦缺血2 h 的腦梗死體積并減輕其神經元損傷［4，5］。MDA 是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的代謝產物。細胞受到氧自由基攻擊從而引發鏈式脂質過氧化反應，產生大量MDA 損傷細胞膜進而使細胞死亡［9］。在本實驗中，我們觀察到30 min 模型組大鼠的MDA 含量低于30 min辛醇組，而2 h 模型組大鼠的MDA 含量高于2 h 辛醇組。故推測腦缺血30 min 后MDA 濃度較低，通過縫隙連接的引導擴散可降低其對腦組織的損傷;而腦缺血2 h 后MDA的濃度過高，通過縫隙連接的擴散則加大對腦組織的損傷。

SOD 則是細胞的抗氧化酶促防御系統，當體內自由基生成增多時，SOD 可清除超氧陰離子，從而保護細胞免受傷害［10］，故SOD 反映了細胞的自我保護能力。在本實驗中，我們觀察到30 min 模型組大鼠的SOD 含量高于30 min辛醇組，而2 h 模型組大鼠的SOD 含量低于2 h 辛醇組。推測在腦缺血30 min 后，較多的SOD 通過縫隙連接的擴散可降低腦組織損傷;而腦缺血2 h 后，SOD 的濃度相對不足很難通過擴散對腦組織進行有效地保護，故組織損傷加重。

綜上所述，本實驗結果表明，縫隙連接抑制劑辛醇對不同缺血時間的雙向作用可能與MDA 和SOD 有關，初步論證了國內外學者對縫隙連接在腦缺血中的作用與腦缺血的損傷程度有關的推測［11，12］:如果損傷程度輕，通過縫隙連接引導的有害物質擴散使得損傷性分子的濃度下降，緩沖了它們對神經元的毒性作用占據主要地位，從而起到保護作用;反之如果腦缺血很嚴重，損傷性分子的濃度升高，通過縫隙連接引導的擴散會損傷到星形膠質細胞自身(bystander death)，清除損傷性分子的能力大大下降，從而增加腦缺血的損傷區域。

［1］Farahani R，Pina-Benabou MH，Kyrozis A，et al.Alterations in metabolism and gap junction expression may determine the role of astrocytes as“good samaritans”or executioners［J］.Glia，2005，50(4):351-361.

［2］Lin JH，Lou N，Kang N，et al.A central role of connexin 43 in hypoxic preconditioning［J］.J Neurosci，2008，28(3):681-695.

［3］牛曉珊，瑪依努爾買買提，黨 輝，等.縫隙連接蛋白-43 阻斷劑辛醇對小鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用［J］.中風與神經疾病雜志，2012，29(5):409-411.

［4］Ding W，Zhou L，Liu W，et al.Opposite effects of the gap junction blocker octanol on focal cerebral ischemia occluded for different durations［J］.Mol Med Rep，2014，9(6):2485-2490.

［5］劉 微，丁文婷，關 莉，等.縫隙連接抑制劑辛醇對腦缺血不同時間再灌注大鼠腦梗死體積和神經元損傷的影響［J］.臨床神經病學雜志，2013，26(5):355-357.

［6］Katsuta K，Umemura K，Ueyama N，et al.Pharmacological evidence for correlation between hippocampal CA1cell damage and hyperlocomotion following global cerebral ischemia in gerbils［J］.Eur J Pharmacol，2003，467(1):103-109.

［7］Liu S，Levine SR，Winn HR.Targeting ischemic penumbra:part I from pathophysiology to therapeutic strategy［J］.J Exp Stroke Transl Med，2010，3(1):47-55.

［8］Rossi DJ，Brady JD，Mohr C.Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia［J］.Nature neurosci，2007，10(11):1377-1386.

［9］Jarasch ED，Bruder G，Hei HV，et al.Singificance of xanthine oxidase in capillary endothialcell［J］.Acta Pysiol Scand Suppl，1986，548:39-46.

［10］Blech DM，Borders CL.Hydroperoxide anion，Ho-2，is an affinity reagent for the inactivation of yeast c/z superoxide dismutase modification of one histidene persubunit［J］.Arch Biochem Biophys，1983，224(2):579-586.

［11］Contreras JE，Sanchez HA，Veliz LP，et al.Role of connexin-based gap junction channels and hemichannels in ischemia-induced cell death in nervous tissue［J］.Brain Res Brain Res Rev，2004，47(1):290-303.

［12］Perez Velazquez JL，Frantseva MV，Naus CC.Gap Junctions and Neuronal Injury:protectants or executioners［J］.Neuroscientist，2003，9(1):5-9.