肺炎克雷伯菌耐藥機制的研究進展*

林華勝 張薇 李國明

肺炎克雷伯菌（KPN）是重要的條件致病菌和醫源性感染菌之一。近年來，由于臨床上抗菌藥物的大量應用和濫用，致使KPN耐藥率居高不下，直接影響到臨床治療效果。Amazian等[1]研究顯示，肺炎克雷伯菌占地中海地區醫院內感染的9.2%；2011年全國醫院感染監控網醫院感染病原菌分布調查顯示KPN占9.03%，成為國內醫院感染的第二大病原菌[2]。國外曾經報道一組由多重耐藥KPN引起醫院內感染的暴發流行，死亡率高達40%[3]。KPN主要耐藥機制包括產生抗菌藥物滅活酶、藥物作用靶位的改變、抗菌藥物滲透障礙（生物被膜、外膜孔蛋白缺失）、主動外排泵系統的亢進作用等，同時抗菌藥物耐藥基因借助質粒、轉座子、整合子的播散也是耐藥菌株臨床加劇的重要原因。本文對上述耐藥機制的研究進展作一簡要綜述。

1 產生抗菌藥物滅活酶

細菌可產生許多能引起抗菌藥物滅活的酶，主要包括β-內酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶（AME）。KPN對β-內酰胺類藥物耐藥的主要機制之一是產生β-內酰胺酶。它可通過水解β-內酰胺環，使β-內酰胺類藥物水解從而失去抗菌活性，其水解率是細菌耐藥性的主要決定因素。KPN產生的β-內酰胺酶主要包括產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）、質粒介導的AmpC酶、耐酶抑制劑的β-內酰胺酶（IRBLs）及碳青霉烯酶（KPC酶）等。

1.1 產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）ESBLs是KPN耐藥產生的最主要的一類酶。1983年由德國報告了世界上第一例ESBLs，1994年在中國醫學科學院北京協和醫院發現國內首例ESBLs感染，迄今已報告的ESBLs的代表菌株有肺炎克雷伯桿菌、大腸桿菌等。ESBLs是由質粒介導的絲氨酸蛋白衍生物，通過水解青霉素、廣譜及超廣譜頭孢菌素及單環β-內酰胺類藥物的β-內酰胺酶，導致此類抗菌藥物耐藥，可被β-內酰胺酶抑制劑如克拉維酸鉀所抑制，但羅燕萍等[4]報道，產ESBLs的PKN對酶抑制劑復合抗生素也有較高的耐藥率。

ESBLs以TEM型和SHV型最常見，CTX-M型是我國的主要基因型。TEM型ESBLs主要對青霉素、氨芐西林及頭孢他啶等一代頭孢菌素耐藥，但對頭孢噻肟敏感，對舒巴坦和克拉維酸耐藥是所有CTX-M型酶的特點。SHV型ESBLs由質粒介導或染色體編碼產生，主要引起細菌對第一代頭孢菌素和青霉素耐藥，SHV-1型對阿莫西林、氨芐西林等青霉素類抗菌藥物有較強的水解作用。目前用于治療產ESBLs菌所致感染的藥物有碳青霉烯類、頭霉素類抗生素，亞胺培南具有超廣譜、高效的抗菌活性，是治療ESBLs菌感染的首選藥物。

1.2 質粒介導的AmpC酶 AmpC酶由AmpC基因編碼產生，AmpC基因表達同時受AmpD、AmpR、AmpG等多種基因的調控。質粒介導的AmpC酶是由位于腸桿菌屬、假單胞菌屬及沙雷菌屬等菌屬染色體上的AmpC基因通過基因轉移方式轉到KPN的質粒上，伴隨細菌復制而編碼產生，其容易引起KPN或大腸埃希菌對第三代頭孢菌素或酶抑制劑的耐藥[5]。自1988年發現首例質粒介導的AmpC酶MRI-1，迄今已有40余種基因型，世界范圍內以CMY-2型多見，國內主要為DHA-1型和ACT-1型，多在克雷伯菌、大腸埃希菌和沙門菌等菌屬中呈持續高表達狀態傳播。近年還發現AmpC酶不僅由染色體介導，也可由質粒介導，且質粒介導者因其具有較快的傳播速度和較強的耐藥性，導致耐藥性的廣泛傳播，這都成為臨床抗感染治療較棘手的問題[6]。

質粒介導的AmpC酶與ESBLs的區別在于前者能水解第3代頭孢菌素類、單環內酰類和頭霉素類（附ACC1外），而且不受酶抑制劑的抑制作用，對類碳青霉烯類藥物或第4代頭孢菌素敏感。但Wang等[7]研究發現，缺失一種39×103大小的外膜蛋白的產DHA-1的KPN對碳青霉烯類藥物的敏感性出現不同程度的降低。Bidet等[8]研究發現，產ACC1的KPN在缺失一種36×103大小的外膜蛋白后，對亞胺培南產生了耐藥性。

1.3 耐酶抑制劑的β-內酰胺酶（IRBLs）IRBLs是一種不受酶抑制劑所抑制的β-內酰胺酶，屬于Ambler分子分類的A類、Bush功能分類的2br亞類，TEM型是主要來源，由TEM-1、TEM-2、SHV-1基因發生突變形成，其他還有SHV-10、SHV-49、OXY-2以及OXA型的β-內酰胺酶等。KPN對酶抑制劑的主要耐藥機制是由質粒介導β-內酰胺酶基因特別是TEM-1基因發生突變后，產生了TEM型β-內酰胺酶而引起對酶抑制劑耐藥。其特點容易導致KPN對阿莫西林、替卡西林及其酶抑制劑克拉維酸、舒巴坦及其復合抗生素耐藥，但對窄譜頭孢菌素、7-α-甲氧基頭孢菌素和氧亞氨基頭孢菌素敏感。

1.4 碳青霉烯酶（KPC酶）KPN對碳青霉烯類最主要的耐藥機制的是產生KPC酶，它能水解包含碳青霉烯類抗生素在內的幾乎所有β-內酰胺類抗生素，而且絕大多數對β-內酰胺酶抑制劑具有抗性。這些酶以產KPC酶為主，主要由質粒介導，包括Ambler分類的A、D類KPC酶和B類金屬β-內酰胺酶。KPN容易引起碳青霉烯類、廣譜頭孢菌素類、青霉素類或單環類抗菌藥物產生耐藥。

KPC酶最早由Yigit等[9]于2001年在美國北卡羅來納州的KPN中發現，屬于KPC-1型；國內于2006年首次報道在一株KPN中檢測到KPC-2。至今已發現的KPC酶有KPC-1~11共11種類型，其中以KPC-2和KPC-3在臨床分離菌株中最為常見，且是引起大多數爆發流行的主要類型[10]。2005年和2011年在美國先后發生了碳青霉烯類抗生素耐藥的KPN流行[11-12]。我國2010年CHINET耐藥監測數據表明，KPN對碳青霉烯類的耐藥率為10%，由此可見KPC酶介導的耐藥將成為KPN耐藥的重要機制之一[13]。

另外，KPN也會產生氨基糖苷類鈍化酶（AME），這是引起細菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的主要機制。

2 藥物作用靶位的改變

在KPN中，編碼拓撲異構酶Ⅳ的parC基因及編碼DNA旋轉酶的gyrA基因靶位出現變異時，這兩類酶的結構構象容易發生變化，致使酶-DNA復合物與抗菌藥物不能穩定結合，達不到干擾細菌DNA合成的作用，最終引起KPN對喹諾酮類耐藥。gyrA基因變異在基因靶位的變異中起主導作用，位于gyrA的絲氨酸Ser83和天冬氨酸Asp87，絲氨酸Ser80和parC的谷氨酸Glu84是最常見變異位點。高山等[14]研究應證了第83位氨基酸的改變是喹諾酮類耐藥的主要原因。

質粒介導的耐藥基因qnr是另一種耐藥機制，其通過編碼蛋白與拓撲異構酶Ⅳ進行特異性結合，減少喹諾酮類藥物的作用靶位從而產生細菌耐藥。李娟等[15]報道，在37株KPN中檢測到有7株攜帶qnrS基因，且全部具有多重耐藥性，只有對亞胺培南敏感。

3 抗菌藥物滲透障礙

3.1 生物被膜（BF）BF是細菌吸附在機體腔道黏膜表面，通過分泌多糖蛋白復合物包繞而形成的膜狀物。BF可通過物理阻擋作用阻止外來大分子物質的滲入，同時與抗菌藥物結合制約其進入到細菌生物被膜內部，最終導致細菌接觸到的抗菌藥物濃度過低產生耐藥。Anderl等[16]通過用10倍MIC濃度的氨芐西林對抗浮游生長和生物被膜狀態的KPN，證明BF可以阻止藥物滲入而使氨芐西林產生耐藥性。Yang等[7]還發現BF菌的特殊結構和生理特性使菌體內抗菌藥物濃度明顯降低，有更多機會誘導浮游生長菌產生β-內酰胺酶而引起耐藥。

3.2 外膜孔蛋白缺失 KPN等革蘭陰性菌細胞外膜脂多層中存在由許多微孔蛋白組成的孔道，它是一種非特導性的、跨越細胞膜的水溶性擴散通道，一些β-內酰胺酶類藥物可經通道進入菌體內而發揮作用。若微孔蛋白發生改變或缺失，抗菌藥物將難以滲入細菌胞內而出現耐藥。氨基糖苷類等抗菌藥物因尚有其他通道進入，故影響不大。

KPN的孔蛋白最常見發生耐藥是OmPK35，其他還有OmPK36、OmPK37等。孔蛋白的改變增加細菌耐藥性，與滅活酶并存時的耐藥程度比滅活酶單獨作用時高。Webster等[18]報道，OmpK35和OmpK36的缺失可導致KPN對美羅培南耐藥。

4 主動外排泵系統的亢進作用

在KPN的內膜上存在能量依賴性蛋白外排泵的外排系統，能主動將滲入細菌體內的的藥物不斷泵出。當細菌體內某種調節機制發生改變，導致主動外排系統表達亢進，使菌體內的藥物濃度不足以發揮抗菌作用而導致耐藥。這是KPN產生多重耐藥的重要機制之一。由于這種系統是非專一性的，廣泛包括內酰胺類、喹諾酮類、大環內酯類等抗菌藥物在內的外排底物，往往多種主動外排系統并存于同一株細菌，因此可導致細菌對各種完全不同結構的抗菌藥物的產生耐藥。馬建新等[19]和彭少華等[20]研究發現，多藥耐藥KPN抗菌制劑外排泵基因攜帶率較高。

5 整合子

整合子是由Hall于1989年首次發現提出的概念。它是一種能被識別和俘獲的外源性可移動基因，其位于細菌的質粒或染色體上，是攜帶編碼抗菌藥物耐藥基因盒的DNA片斷，它具有位點特異性的基因重組系統。研究表明，整合子不僅能通過介導細菌耐藥性群聚而產生多重耐藥性，而且可在菌種和不同遺傳物質間轉移，引起耐藥基因快速廣泛播散[21]。整合子作為遺傳的基因元件普遍存在革蘭陰性菌中，根據整合酶基因同源性主要分4類，與細菌耐藥性密切相關主要有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子。其中Ⅰ類整合子在臨床分離菌株中分布最廣泛，由 5′ 保守區（5′ CS）、3′ 保守區（3′ CS）和兩者之間的可變區3個部分組成，其攜帶的耐藥基因盒包括對氨基糖苷類、磺胺、喹喏酮類和消毒劑等130多種，其編碼產物可賦予細菌對全部臨床常用藥物種類產生耐藥，因此Ⅰ類整合子是目前整合子研究的熱點。研究表明，細菌1個整合子同時能夠捕獲多個基因盒表達出對不同抗菌藥物的多藥耐藥性，而整合子內部包含某些ESBLs編碼基因更易促使攜帶整合子的產ESBLs菌株表達出擴散優勢。研究證明，在產ESBLs的KPN中已經相當普遍存在Ⅰ類整合子[22-23]。Ⅱ類整合子在細菌中分布比較為局限，主要分布在志賀菌屬中，大腸埃希菌、變形菌屬、沙門菌屬等也曾發現。李濤等[24]從98株KPN中檢出攜帶Ⅱ類整合酶基因的陽性率僅為1%，提示KPN中Ⅱ類整合子的攜帶率較低。Ⅲ類整合子至今檢出極少。

6 結語

綜上所述，由于微生物等對藥物耐藥性的廣泛出現，使抗感染治療重新成為一個棘手的問題。KPN作為一種條件致病菌所引起的感染在細菌感染性疾病中的比重日漸增加，其耐藥機制非常復雜多變，抗菌藥物對其產生的耐藥性日趨嚴重，許多領域仍亟待更深一步的探索研究。在臨床治療中，醫務工作者要逐步掌握細菌的耐藥特性，研制并合理、有效使用抗生素，提高抗感染的成功率。

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