p53、PUMA、MCL-1對于凋亡途徑的調控

師迎旭(綜述)，蘇秀蘭(審校)

(內蒙古醫科大學附屬醫院臨床醫學研究中心，呼和浩特 010050)

自1979年以來，p53被證實主要在維護基因組的穩定性和調節細胞凋亡中發揮重要作用。目前，p53在其他方面的作用也逐步被發現[1]。激活的p53可以抑制細胞轉化、誘導細胞生長停滯、細胞凋亡、DNA修復和分化受損。已經發現的p53靶基因超過16個，但目前仍不清楚哪一個是起決定作用的。p53能激活多條信號途徑參與調節細胞凋亡：Fas、PIDD、DR5；Bax、Noxa、p53基因上調凋亡調控因子(the p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)、p53AIP；PIGs；Soctin、PERP、PAG608、Siah；IGF-BP3。關于p53基因如何抑制腫瘤的發展仍是研究的熱點。

1 p53的凋亡通路

腫瘤抑制基因p53和原癌基因Bcl-2是p53凋亡通路中兩個最早被確定的基因。經研究發現，這兩種基因和蛋白之間具有很強的遺傳和生理關系。越來越多的報道顯示，p53主要通過與Bcl-2家族蛋白相互作用發揮促凋亡與抗凋亡的功能[2]。Bcl-2最初是在非霍奇金濾泡狀B細胞淋巴瘤中分離并命名的。Bcl-2家族成員具有較高的同源性，具有一個或多個Bcl-2的同源性(Bcl-2 homology，BH)結構域(BH1、BH2、BH3、BH4)，可以形成異二聚體。根據作用其可分為兩類：①抗凋亡作用，如Bcl-2、Bcl-xL、髓細胞白血病基因1(myeloid cell leukemia-1，MCL-1)、Bcl-w、秀麗線蟲基因9等；②促凋亡成員，如Bax、Bak、PUMA、Noxa、Bim、Bcl-xs、Bad、Bik、Bid等。抗凋亡和促凋亡家族蛋白之間平衡的改變決定了細胞是否進入凋亡過程。

促凋亡的Bcl-2蛋白家族成員共同含有BH3結構域(BH3-only)，能夠編碼Bid。接受凋亡信號后，Bid與Bcl-2家族蛋白Bax和Bak相互作用，使Bax蛋白嵌入到線粒體外膜中，增強線粒體外膜的通透性，導致釋放細胞色素C和其他促凋亡因子,如第二線粒體衍生的胱天蛋白酶(caspase)激活劑/低等電點凋亡抑制蛋白直接結合蛋白的釋放[3]。Bid可誘導Bcl-2或Bcl-xL釋放出Bid和Bim促進凋亡。p53蛋白在細胞應急情況下被激活，同樣具有BH3-only相似的功能和轉錄因子作用，p53致Bid的表達上調，調節下游靶基因參與p53介導的細胞凋亡過程調。此外，在細胞凋亡中p53還具有獨立的轉錄作用。p53通過與Bax的相互作用，促進Bax的活化和Bax蛋白插入到線粒體膜中，使線粒體通透性增加。

2 PUMA對于p53凋亡通路的調控

Bcl-2在細胞凋亡調控機制中起著十分重要的作用。實驗發現，Noxa和PUMA(bbc3)編碼的BH3也較為重要[4-6]。PUMA和Noxa基因的轉錄均受p53正性調控，參與全部的p53介導的凋亡信號。Noxa由PMAIP1(佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酰引導蛋白1)基因編碼，具有2個BH3結構域，可以泛素化降解Mcl-1[7]。X射線照射小鼠后可激活依賴p53的凋亡途徑，從而誘導Noxa表達。Noxa是唯一編碼BH3的Bcl-2家族成員，只具有BH3區域，而沒有其他BH域。研究發現，Noxa在非依賴p53的凋亡途徑中起重要作用[8]。Noxa通過介導非p53的凋亡過程，經BH3與線粒體和抗凋亡的Bcl-2家族成員相互作用，直接激活Noxa及其他凋亡蛋白，導致caspase-9的激活，但此過程并不會增強PUMA水平。

PUMA是于2001年被發現的一種具有促凋亡作用的p53靶基因，高度保守[9-11]。PUMA在正常狀況下低表達，應激后可以迅速誘導激活PUMA，參與p53依賴性和非依賴性細胞凋亡過程，受轉錄因子調控，而不是翻譯后修飾調控。被激活后，PUMA與抗凋亡Bcl-2家族成員相互作用，從而釋放Bax和(或)Bak，啟動線粒體凋亡信號。線粒體功能障礙將激活caspase級聯，最終導致細胞死亡。實驗證明，PUMA在DNA損傷激活的p53介導的凋亡途徑中更為重要，而Noxa作用相對有限[12]。PUMA具有4種亞型(α、β、γ、δ)，其中γ、δ缺少BH3結構域，無法誘導細胞凋亡[13]。PUMA的促凋亡作用：一方面，PUMA介導p53依賴的所有凋亡信號[14-16]。研究發現，DNA損傷誘導的凋亡過程中，p53和PUMA啟動子上p53結合位點的結合是必不可少的[17]。PUMA的啟動子具有兩個p53結合區，對于PUMA與p53的結合，PUMA的活化至關重要。p53與PUMA啟動子的結合有利于核心組蛋白的修飾，如乙酰化組蛋白H3和H4，促進染色質結構開放和轉錄激活。PUMA基因缺失的動物或細胞，導致p53喪失誘導凋亡功能，而其他的p53靶基因(如Bak基因)缺失，不會阻礙p53的誘導凋亡作用。小鼠實驗證實，盡管僅剔除PUMA能夠抵制etoposide(拓撲異構酶Ⅱ抑制劑足葉乙苷)與γ射線的促凋亡作用，不會使淋巴細胞死亡，但Noxa或PUMA的任何一個因子的降解都會減少成纖維細胞中由于DNA降解引起的細胞凋亡[14]。另一方面，PUMA可介導p53非依賴的凋亡信號[18-20]。缺少PUMA，人結腸癌細胞的p53依賴凋亡過程被抑制。缺失PUMA的淋巴細胞還可以抵制細胞因子缺失、地塞米松、星形孢菌素引發的凋亡過程[21-24]。PUMA誘導細胞凋亡可通過激活多種凋亡蛋白如Bax和(或)通過其抗凋亡的Bcl-2家族成員，從而引發線粒體功能障礙和caspase激活。PUMA也可以直接激活Bax/Bak或細胞質的p53誘導的線粒體功能障礙，使細胞進入凋亡途徑。此外，PUMA也是內質網應激標志分子CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白的下游分子，介導內質網應激途徑誘導的細胞凋亡，并通過調控內質網應激標志分子葡萄糖調節蛋白78的表達，參與內質網應激途徑誘導的細胞凋亡[25-26]。

3 MCL-1對于p53凋亡通路的調控

研究顯示，PUMA對于細胞凋亡發揮著重要作用，它除了受p53的調控，還受其他因子的調節，如MCL-1[27-28]。MCL-1屬于抗凋亡Bcl-2家族蛋白的一員，通過不同的剪接方式可生成兩種變體：選擇性剪接較長的變體(異構體1)可通過抑制細胞凋亡，提高細胞的存活；而剪接較短的變體(異構體2)則促進細胞凋亡和死亡誘導。MCL-1可以作為上游的分子，通過阻止細胞色素C的釋放從而阻斷多種凋亡誘導劑所誘導的細胞凋亡，然而MCL-1抑制細胞凋亡的分子機制尚未闡述清楚。研究顯示，缺失MCL-1可以破壞p53-Bak復合物的形成，過表達MCL-1可以促進惡性腫瘤細胞生存[29]。MCL-1是一個很不穩定的蛋白質，它的快速誘導表達和降解表明，它在細胞為適應周圍環境迅速變化的凋亡調控中具有重要作用。其蛋白表達水平受到極其嚴格而復雜的調控，提示其在細胞受到應激發生變化時，對細胞的存活與否發揮著關鍵作用。

4 MCL-1與PUMA在p53凋亡通路中的作用

MCL-1可以直接或間接地激活Bcl-2家族促凋亡蛋白Bak與Bax抑制細胞凋亡。MCL-1通過與Bim或Bak形成異源二聚體中和凋亡蛋白的作用，抑制細胞色素C的釋放及細胞凋亡。MCL-1可以通過BH1結構域和PUMA的BH3結構域相互作用，在內質網應激過程中抑制MCL-1可以通過上調PUMA來激活Bak與Bax。另外，腫瘤壞死因子相關凋亡配體可以通過死亡受體途徑激活caspase-8和caspase-3，而活化的caspase-8或caspase-3可以切割抗凋亡的MCL-1，當MCL-1被切割后，將阻止與促凋亡的Bcl-2家族成員(如Bim)間形成復合體，最終通過線粒體途徑導致細胞凋亡[26,30-31]。免疫熒光實驗顯示，MCL-1和PUMA共同定位于線粒體，表明MCL-1和PUMA在線粒體上結合[32]。進一步研究發現，MCL-1可以抑制PUMA誘導的細胞凋亡，且MCL-1的BH1結構域對于其抗PUMA誘導的細胞凋亡起著重要的作用[33]。MCL-1的蛋白穩定性可以被PUMA提高，而且這種MCL-1蛋白穩定性的提高是由于和PUMA的直接結合所致。研究顯示，將PUMA的BH3結構域去除之后，PUMA失去提高MCL-1蛋白穩定性的功能；同時也證明了PUMA結合MCL-1只能部分阻止MCL-1的快速降解，提示除了PEST(為一富含脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸的約10個氨基酸組成的結構序列)和BH1結構域介導MCL-1的快速降解，還存在其他降解信號，而且位于MCL-1蛋白的C末端[34]。該項研究闡明了Mcl-1可以與PUMA相互作用，而且提示MCL-1可能通過與PUMA結合而提高自身穩定性，最終行使抗凋亡的功能[35-36]。在紫外線誘導的細胞凋亡過程早期，p53能被激活，并作為一個轉錄因子，誘導多種與凋亡相關蛋白的表達。細胞接受凋亡刺激后，胞內p53水平增加，進入胞質p53與MCL-1競爭結合Bak，使MCL-1釋放Bak，引起Bak寡聚化，MCL-1缺乏。Bak的寡聚化能增加線粒體外膜通透性，最終激活線粒體途徑的細胞凋亡[37]。

作為一種腫瘤抑制基因，p53的主要功能是調節細胞生長停滯和凋亡，通過平衡這兩種細胞的生命活動，最終決定細胞的命運。不同于其他的腫瘤抑制基因，大多數腫瘤中的p53突變的錯義類型，會導致單個氨基酸的變化，影響蛋白質上的DNA結合域，表明與DNA序列特異性結合是抑制p53活性與逃脫腫瘤命運的關鍵。

5 小 結

p53被證明在多種凋亡刺激所誘導的細胞凋亡過程發揮著關鍵的作用，但是它的誘導凋亡的潛在機制還不明確。隨著研究的深入，人們發現p53的下游分子PUMA誘導凋亡功能十分重要，具有重要的促凋亡作用。通過誘導細胞色素C從線粒體釋放，激活caspase-9從而引發凋亡。PUMA的缺失能夠阻礙DNA損傷，激活p53引發的凋亡過程。此外，PUMA的缺失也可以抑制多種凋亡因子的誘導凋亡途徑。p53的另一個下游分子MCL-1是一個抗凋亡分子，通過抑制細胞色素C從線粒體釋放，抑制caspase-9，從而阻礙凋亡的發生。Mcl-1與PUMA可以在線粒體通過Bcl-2家族蛋白的BH結構域(BH1與BH3)發生相互作用，通過相互作用可以提高Mcl-1的穩定性，最終抑制細胞的凋亡途徑。當細胞受到刺激損傷時，會引發p53的凋亡通路，p53通過PUMA促進細胞凋亡；如果細胞癌變，則細胞就會逃離凋亡的命運，p53可能會通過調節Mcl-1的活性，阻礙細胞的凋亡過程，但具體機制尚不清楚，有待進一步的研究。

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