羧甲基決明子多糖的制備及表征

柳夢思，牛春梅，李紹英

（河北科技大學材料科學與工程學院，河北石家莊 050018）

決明子主要指小決明或鈍葉決明的干燥種子［1］，是國家衛生部頒布的藥食同源植物。其具有降壓、降脂、明目保肝、抑菌等廣泛的醫藥作用，又可用于飲品、軟糖、冰淇淋、保健啤酒、酸奶等［2］。決明子在中國分布廣、來源易、價格低，且提取方便，擁有廣闊的市場前景和經濟效益［3］。

決明子多糖主要由甘露糖和半乳糖構成，由呋喃鏈接，半乳糖與甘露糖質量比為1∶5，其相對分子質量為21萬左右［1］。決明子多糖具有水不溶物含量高、不能快速溶脹和水合、溶解速度慢，以及黏度不易控制、耐電解質、耐剪切性較弱、易被生物降解、難以長期保存、水溶液顏色較深等缺點［4］，限制了決明子多糖的進一步應用。因此，對決明子多糖進行化學改性，改善其水溶性及易生物降解性是非常必要的。

決明子的研究主要集中于其成分、藥理、結構、提取工藝和食品應用等方面［5-6］，但對決明子多糖化學改性研究較少。李紹英等研究了陽離子決明子多糖的制備［7］，GUPTA等合成了氨基甲酰甲基化決明子多糖［8］，SHARMA等研制了氰乙基化決明子多糖，改善其水溶性及透明性，但工藝復雜，副反應較多［9］。目前，僅有少量幾篇論文介紹決明子多糖的羧甲基化改性，取代度均小于0.23，且只研究了羧甲基決明子多糖合成工藝，對其溶液各項性能及結構分析研究甚少［6，10］。由王繼芝等和孫志敏等研究表明，引入羧甲基基團能有效提高多糖的水溶性［11-12］。因此，本實驗以決明子多糖（CTG）為原料，氯乙酸（MCA）為醚化劑，異丙醇水溶液為分散劑，制備了高取代度羧甲基決明子多糖，并對其黏度、透明性和穩定性進行了一系列測試，為改性決明子多糖的進一步應用提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 原料及儀器

1）試劑：決明子多糖原粉，河南商丘益源科技有限公司；氯乙酸，分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司；NaOH和異丙醇，分析純，天津市百世化工有限公司。

2）儀器：NDJ型旋轉式黏度計，上海精密科學儀器有限公司；721型分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；Prestige-21型傅里葉變換紅外光譜測試儀，日本島津公司；日本JNM-AL300型核磁共振儀，日本電子株式會社；METZSCH STA 449C型熱重分析儀，梅特勒-托利多公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羧甲基決明子多糖的制備

將16.2 g決明子多糖粉和一定質量的75%（體積分數）異丙醇置于100 m L三口瓶中，加入氫氧化鈉，在恒溫條件下攪拌均勻，預處理30～75 min后，加入一定量的氯乙酸溶液，控溫在50～60℃，反應2.5～3.5 h，過濾，所得濾餅用60%（體積分數）乙醇溶液進行洗滌。然后在50℃烘干至恒重。取出產品裝入密封袋保存，稱重，以便測試其性能時使用。

1.2.2 羧甲基取代度的測定

參照文獻［13］羧甲基羅望子取代度的測定方法測定羧甲基決明子多糖的取代度。

1.2.3 溶液黏度的測定

將產品配置成一定濃度的水溶液，攪拌均勻，調p H值為7～8，靜置24 h。參照文獻［14］，測試其黏度，每組測試3次取平均值，作為黏度值。

1.2.4 透光率的測定

將產品配置成2%（質量分數）的溶液，攪拌均勻，調p H值為7～8，靜置24 h。然后將溶液裝入比色皿中，選擇波長為524 nm，以蒸餾水做參照比（蒸餾水透光率為100%），每組試樣測試3次，取其平均值作為透光率。

1.2.5 FTIR測試

用KBr壓片法，采用Prestige-21型紅外光譜儀對決明子原粉和羧甲基決明子多糖進行紅外掃描，波長范圍為400～4 000 cm-1。

1.2.613C-NMR圖譜測試

將樣品用無水乙醇萃取數次后進行真空烘干。以D2O為溶劑，用日本JNM-AL300型核磁共振儀測定決明子多糖及羧甲基決明子多糖的13C-NMR譜圖。

1.2.7 TGA-DAT分析

用NETZSCH STA 449C型熱分析儀對測試樣品在N2氛圍下進行TGA分析。其中測定溫度范圍為10～500℃，升溫速度為10℃／min。

2 結果與討論

2.1 FTIR分析

從表1中可看出，決明子原粉的特征吸收峰：3 425 cm-1處為O—H伸縮振動，2 924 cm-1處為C—H伸縮振動，1 151 cm-1處為C—O伸縮振動。羧甲基決明子多糖在1 621，1 416，1 325 cm-1處出現新的特征峰。1 621 cm-1特征峰是—COO—的非對稱伸縮振動，1 416 cm-1和1 325 cm-1為—COO—的對稱伸縮振動，表明羧甲基的存在。表明羧甲基已引入決明子多糖分子上，證明了決明子多糖羧甲基化的可行性。

表1 FTIR峰值表Tab.1 FTIR spectrum of CTG and CM-CTG

2.2 13 C-NMR分析

如圖1所示，決明子多糖在61.1×10-6，72.3×10-6，102.6×10-6處分別為C-1，C-2，C-3的特征峰。羧甲基決明子多糖除以上3個特征峰外，在175.5×10-6處存在—COONa的特征峰。因此，決明子多糖分子上存在羧甲基鈉基團，證明了羧甲基化反應的成功。

圖1 羧甲基決明子多糖與決明子原粉的13 C-NMR譜圖Fig.1 13 C-NMR spectra of CM-CTG and CTG

2.3 TGA-DAT分析

多糖的熱失重數據將為樣品的熱穩定性提供重要數據。由圖2可知，100℃之前樣品的質量小幅度快速減少，說明水分和小分子揮發流失；決明子多糖在190～304℃快速降解，質量損失約為50%。溫度繼續升高，產品質量變化較小，主要為分解后得到的碳化物與灰分。羧甲基決明子多糖在190～283℃范圍內發生降解，分解溫度比原粉降低，因為改性過程使得決明子多糖分子發生一定程度的降解，使得產品耐熱性稍有下降。且由于產品后期的洗滌過程使得羧甲基決明子多糖灰分降低，質量損失約為60%。

圖2 決明子多糖原粉和羧甲基決明子多糖的熱失重曲線Fig.2 TGA-DAT pattern of CTG and CM-CTG

2.4 氯乙酸用量對羧甲基化反應的影響

氯乙酸在反應中作為醚化劑，堿用量不變，與決明子多糖進行反應將羥基轉變為羧甲基鈉，從而對決明子多糖進行改性。氯乙酸與決明子多糖的物質的量比n（MCA）／n（CTG）對羧甲基決明子多糖取代度（以下簡稱DS）的影響如圖3所示。

由圖3可知，在一定范圍內隨著n（MCA）／n（CTG）的增大，產品取代度逐漸升高，且于物質的量比為1.6時，達到較大值0.60，此后隨著n（MCA）／n（CTG）的繼續增大，產品取代度逐漸降低。氯乙酸作為羧甲基化反應的醚化劑，隨著n（MCA）／n（CTG）的增大，醚化劑濃度逐漸升高，有效加速羧甲基化反應的進行，醚化反應向生成物方向移動，使得產品取代度增大。當n（MCA）／n（CTG）繼續增加至2.0時，取代度降至0.19，因為在反應過程中，當n（MCA）／n（CTG）超過一定值后，由于氯乙酸與氫氧化鈉的中和反應，使得體系氫氧化鈉濃度不斷下降，決明子多糖溶脹程度減弱，反應物難以進入決明子多糖顆粒中進行反應；同時，體系堿性下降，不利于羧甲基化反應，若進一步增加氯乙酸用量，產品取代度也會隨之下降。由此可知n（MCA）／n（CTG）較佳值為1.6∶1。

2.5 固液比

固液比在一定條件下直接影響決明子多糖的溶脹和反應物濃度，進而影響羧甲基化的反應程度。實驗研究了羧甲基決明子多糖取代度隨固液比的變化趨勢，實驗結果如圖4所示。

圖3 氯乙酸與決明子多糖的物質的量比對DS的影響Fig.3 Dependence of n（MCA）／n（CTG）on DS

圖4 固液比對DS的影響Fig.4 Dependence ofthe ratio of solid to liquid on DS

由圖4可知，堿化過程中，隨著固液比的降低，NaOH濃度隨之升高，堿化效果提高，醚化過程中氯乙酸鈉濃度提高，產品取代度也不斷提高。由圖4得，提高固液比，副反應變化較小，但增大了決明子多糖與反應試劑的有效碰撞，使得正反應效率提高較大，有效增加了氯乙酸利用率，產品取代度隨之增大。但當固液比小于1∶2.5時，由于分散劑過少，決明子多糖將無法完全分散，同時攪拌過于困難，產品羧甲基基團分布不均，所以固液比為1∶2.5時為較佳固液比。

2.6 堿化時間

堿化過程中，氫氧化鈉與決明子多糖作用，多糖分子間氫鍵打開，促進顆粒溶脹，同時生成氧負離子鈉，促進醚化反應的進行。實驗研究了堿化時間對產品取代度的影響，結果見圖5。

由圖5可知，堿化時間越長，決明子多糖鏈間的氫鍵打開越多，顆粒溶脹程度越大，氯乙酸分子越易滲透到顆粒中，同時生成氧負離子鈉越多，越有利于后期醚化反應的進行，產品取代度逐漸增大。當堿化時間超過60 min時，繼續延長堿化時間，決明子多糖分子斷鍵不斷增多，從而生成較多小分子，洗滌過程中易流失，從而平均取代度稍有下降，說明60 min為較佳堿化時間。

2.7 堿化溫度

由圖6可知，堿化溫度越高，決明子溶脹越好，使分子鏈更易與氫氧化鈉接觸，生成氧負離子鈉越多，越有利于后期醚化反應的進行，提高取代度，但溫度越高副反應越嚴重。40℃時取代度較高。堿化溫度繼續升高，副反應迅速增大，正反應增大較小，表現為取代度急劇下降；堿化溫度由40℃升至55℃，正反應隨溫度變化較小，副反應不斷增大，取代度逐漸減小；溫度增加使得分子鏈斷鍵嚴重，分子量較低的分子鏈在洗滌和提純過程中損失較大，使取代度較小，且產品收率偏低。因此，40℃為較佳堿化溫度。

圖5 堿化時間對DS的影響Fig.5 Dependence of alkalization time on DS

圖6 堿化溫度對DS的影響Fig.6 Dependence of alkalization temperature on DS

2.8 醚化時間

由圖7可知，反應時間過短，氯乙酸與決明子多糖醚化反應時間不足，羧甲基取代度較小，延長反應時間，羧甲基化反應越充分，分子鏈上羧甲基取代基越多，使產品溶解性提高，黏度和透光率增大；但超過3 h后分子鏈斷鍵更嚴重，多糖分子鏈降解增加，副反應增多，小分子在后期洗滌過程中流失，使產品取代度降低，黏度也減小。因此3.0 h為較佳醚化時間。

2.9 醚化溫度

由圖8中可以看出，醚化溫度對反應取代度影響很大。醚化溫度在50℃到53℃之間，隨著溫度的升高，產品取代度隨之增大，達到最高值0.64，此后溫度繼續升高，產品取代度不斷降低。在一定溫度范圍內，醚化溫度越高，越有利于決明子多糖顆粒的溶脹，使得氫氧化鈉、氯乙酸和分散劑更易于滲透入顆粒中，增加了分子間的有效碰撞，同時溫度升高增大了反應試劑的活性，羧甲基取代度不斷增加。當溫度高于53℃時，會促使決明子多糖的降解和反應試劑的分解，提高了副反應程度，降低羧甲基化反應效率，使得羧甲基取代度降低。因此確定較佳醚化溫度為53℃。

圖7 醚化時間對DS的影響Fig.7 Dependence of etherification time on DS

圖8 醚化溫度對DS的影響Fig.8 Dependence of etherification temperature on DS

2.10 耐電解質研究

分子結構中存在活性較高的羧甲基，以陰離子形式存在于離子化溶劑中，陽離子作為抗衡離子分布在高分子陰離子的周圍，平衡部分陰離子靜電場，減弱分子鏈間的相互排斥，從而使多糖分子鏈溶解分散更好，增大了溶液的黏度。

將樣品配置1%（質量分數）的水溶液，在不加入任何鹽溶液的情況下，測得其黏度為132 mPa·s，隨著離子濃度與離子種類的變化溶液黏度的變化趨勢如圖9所示。

從圖9中可以看出，溶液黏度均隨著鹽溶液質量分數的增加而增大。KCl的質量分數（下同）從1%到2%黏度有很大幅度的提高，但隨著KCl濃度的增加，黏度雖然有所波動但趨于145 mPa·s左右，不再發生大的變化，說明2%的KCl溶液對樣品的增稠效果比較明顯。隨著NaCl的質量分數的增加，黏度逐漸增加，但當NaCl的質量分數達到4%時，隨著質量分數的增加，黏度趨于平緩不再變化，說明4%的NaCl溶液對樣品的增稠效果比較明顯。

隨著CaCl2的質量分數增加，黏度明顯上升，說明CaCl2的增稠效果隨著質量分數的增加而增大。Ca2＋不同于Na＋和K＋，為二價陽離子，由于價鍵的鍵橋作用，分子間發生交聯，高分子尺寸增加，分子間纏繞程度增大，因此加入Ca2＋的溶液黏度約是K＋和Na＋的2倍，增稠效果更好。

2.11 質量分數對黏度、透光率的影響

將樣品分別配置質量分數1%，2%，3%，4%，5%的水溶液，測定溶液黏度與透光率隨羧甲基決明子多糖質量分數增大的變化趨勢，如圖10所示。隨著產品質量分數的增加，分子鏈間締合程度不斷增大，黏度呈對數增加，由于溶液濃度的不斷提高，同時溶液中水不溶物含量逐漸增大，透光率逐漸減小，由94%降低至62%。

圖9 電解質質量分數對黏度的影響Fig.9 Dependence of electrolyte on apparent viscosity

圖10 不同質量分數下產品的黏度和透光率Fig.10 Dependence of concentration on transmittance and apparent viscosity

2.12 時間穩定性

將樣品配置成溶液，攪拌均勻，靜置，并開始計時，用旋轉式黏度計測其黏度，記錄所測得數據，研究溶液黏度的穩定性。由圖11可知，在有氧條件下，決明子多糖溶液容易滋生微生物，且隨著時間的增加微生物濃度不斷增大，導致決明子多糖鏈發生降解且發生霉變。酸性條件下多糖鏈中醚鍵發生斷鍵，從而使溶液黏度不斷下降。因此，決明子原粉黏度持續下降，到第5天時黏度僅為初始黏度的43.7%。

決明子多糖進行羧甲基化改性后使其結構發生變化，支鏈增大，羧甲基基團與H＋結合，阻礙了微生物及H＋對多糖鏈的降解作用。由圖11可知，羧甲基決明子多糖溶液在2 d內黏度基本不變，5 d后黏度為初始溶液的76.9%，羧甲基決明子多糖溶液相對于原粉溶液穩定性明顯提高。

圖11 溶液的穩定時間性Fig.11 Time stability of CM-CTG solution

3 結 論

以氯乙酸為醚化劑，氫氧化鈉為催化劑，異丙醇水溶液為分散劑，合成羧甲基決明子多糖。當氯乙酸與決明子多糖物質的量比為1.6∶1，固液比為1∶2.5，堿化時間為60 min，堿化溫度為40℃，醚化時間為3.0 h，醚化溫度為53℃時，產品羧甲基取代度為0.64，羧甲基利用率為79.5%，2%溶液黏度為270 mPa·s，透光率為93.8%。羧甲基決明子多糖溶液黏度2 d內基本不變，5 d后為初始溶液的76.9%，相對于原粉溶液穩定性明顯提高，且在電解質存在條件下溶液黏度提高了25%～35%，可見耐電解質性良好。由TGA分析的，羧甲基決明子多糖熱分解溫度降低。FTIR和13C-NMR分析證明了羧甲基基團的存在，證明了羧甲基化反應的可行性。

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