黑米發酵乳的體外抗氧化活性研究

郭飛翔，韓青青，黃玉軍，顧瑞霞，陳霞，魯茂林

（江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州225127）

黑米發酵乳的體外抗氧化活性研究

郭飛翔，韓青青，黃玉軍，顧瑞霞*，陳霞，魯茂林

（江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州225127）

對黑米發酵乳抗氧化活性進行了研究。結果表明，當黑米發酵乳、普通發酵乳及20%黑米酶解液3種樣品稀釋8倍時，黑米發酵乳清除DPPH·，清除·OH，總抗氧化能力，螯合Fe2+能力都是最強的，分別為60.16%，30.76%，0.847，28.43%，并且都顯著高于普通發酵乳和20%黑米酶解液的抗氧化能力。研究表明，黑米中的抗氧化功能成分與乳酸菌相互促進，發揮了協同作用，提高了黑米發酵乳的功能特性。

黑米；發酵乳；抗氧化；體外

黑米是一種藥、食兼用的米，種植歷史悠久，是我國古老而名貴的糯米類稻米，俗稱“補血米”、“貢米[1]”。黑米中豐富的胡蘿卜素、葉綠素、花青素具有良好的生理功能特性，如防治缺鐵性貧血[2]，降血脂，預防動脈粥樣硬化[3-5]，抗疲勞[6]，抗氧化[7-8]等。黑米發酵乳是將黑米經過酶解，與牛乳混合后進行發酵，牛乳蛋白質作為全價優質蛋白，對谷物中必需氨基酸有互補作用，同時保留黑米的營養成分，不僅使發酵乳口感更好，還可以補充牛乳碳水化合物，為人體提供豐富的膳食纖維、維生素及多種微量元素，并將黑米的功能特性在發酵乳中得到體現，開發黑米食品的新品種。盡管有研究人員從事黑米發酵乳的研究[9-11]，但大都只研究了黑米發酵乳的制作工藝，還沒有人對黑米發酵乳的抗氧化功能進行研究。本研究通過對黑米發酵乳體外抗氧化活性的評價，以期為黑米發酵乳產品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黑米購自揚州農貿市場；α-淀粉酶（20 000U/mL）購自湖州禮來生物技術有限公司；糖化酶（100 000U/g）購自張家港市金源生化有限公司；酸奶發酵菌種為揚州大學乳品研究所分離保藏；脫脂乳粉，全脂乳粉購自新西蘭威士蘭乳業公司；DPPH自由基購自Sigma公司；無水乙醇、三氯乙酸、鐵氰化鉀、抗壞血酸、氯化鈉、氯化亞鐵、硫酸亞鐵、水楊酸和EDTA購自國藥集團化學試劑有限公司；菲洛嗪購自上海生工生物有限公司。

1.2 設備

BOS-60攪拌機：上海標本模型廠；HH-6型數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；BS210S型電子天平（1/10000）：北京賽多利斯天平有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面工作凈化臺：蘇州凈化設備有限公司；755s型紫外分光光度計：上海棱光技術有限公司；SHZ-Ⅲ B型循環水真空泵：上海儀（集團）供銷公司；5804R型冷凍離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 樣品的制備

1.3.1 黑米酶解液的制備

黑米清洗兩遍，然后在55℃下浸泡2 h后趁熱磨漿，過20目篩，加水調整料水比為1∶4，在80℃的水浴鍋中糊化30min，用飽和Na2CO3溶液調節糊化液pH，加入高溫α-淀粉酶95℃下液化，以碘液檢驗至所需DE值后煮沸5min～10min，快速冷卻，用10%檸檬酸溶液調節pH，再加入糖化酶進行糖化，用無水乙醇檢驗至無白色沉淀后，經85℃熱處理10min滅去酶的活力，過100目篩制得黑米酶解液，最后用飽和Na2CO3調節其pH為6.4～6.8，備用。

1.3.2 普通發酵乳的制備

全脂乳（全脂乳粉11.5%，蔗糖5.0%）95℃殺菌5min，冷卻至42℃，并按體積分數3%接入菌種，于42℃培養至pH為4.5左右，迅速置于冰水中冷卻至4℃，并于4℃冷藏24 h。

1.3.3 黑米發酵乳的制備

全脂乳（全脂乳粉11.5%，蔗糖5.0%，黑米酶解液20%），95℃殺菌5min，冷卻至42℃，并按體積分數3%接入菌種，于42℃培養至pH為4.5左右，迅速置于冰水中冷卻至4℃，并于4℃冷藏24 h。

1.4 樣品的處理

稱取冷藏24 h后的黑米發酵乳和普通發酵乳各100 g，采用減壓抽濾的方式進行過濾，并收集濾液，將濾液分別稀釋至0倍、4倍、8倍、12倍、16倍；將黑米酶解液與雙蒸水按1∶4的比例配成20%的黑米酶解液，同時也稀釋至0倍、4倍、8倍、12倍、16倍。

1.5 黑米發酵乳抗氧化活性的測定

1.5.1 黑米發酵乳對DPPH·的清除能力

參照文獻[12]所述方法并略做改動，取樣品2.0mL與2.0mL95%乙醇混勻，再加入濃度0.2mmol/LDPPH溶液2.0mL于具塞試管中，搖勻，避光放置30min后，3 000 r/min條件下離心10min，用95%乙醇作參比測定其吸光度Ai。同時測定0.2mmol/LDPPH溶液與等體積95%乙醇混合液的吸光度Ac，以及待測液與等體積95%乙醇混合液在517 nm處的吸光度Aj。本研究以VC為對照。DPPH·清除率用下式表示：

1.5.2 黑米發酵乳對·OH的清除能力

參照文獻[13]所述方法，將2mL的6mmol/L硫酸亞鐵水溶液與2mL的6mmol/L水楊酸-乙醇溶液混合后，將樣品加入后，再加入2mL的20mmol/L的過氧化氫溶液，混勻后在37℃的恒溫水浴中反應1 h時，3 000 r/min條件下離心10min，取出冷卻后在510 nm處測定吸光值A2。同時測定不加樣品只加H2O2時的吸光值A1，以及用雙蒸水做空白對照時的吸光度A0。本研究以VC為對照。·OH清除率用下式表示：

1.5.3 黑米發酵乳總抗氧化能力

參照文獻[14]所述方法并略做改動，將樣品1.0mL與2.0mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH6.6）混合，再加入1%的鐵氰化鉀2.0mL。混合物于50℃水浴20min后，加入1.0mL10%的三氯乙酸，4 000 r/min 10min，取上清液2.5mL，加雙蒸水2.5mL和0.1%的FeCl30.5mL反應10min后，700 nm處測吸光度。吸光度越高，說明反應混合物的還原性越強，樣品的總抗氧化能力越強。

1.5.4 黑米發酵乳對Fe2+螯合能力

參照文獻[15]所述方法并略做改動，取2mL樣品，加入2mL 0.01mmol/LFeCl2·4H2O溶液和2mL 0.25mmol/L菲洛嗪，振蕩混勻。反應混合物靜置10min，在562 nm下測定吸光度As，用雙蒸水做空白對照測定吸光度Ac。本研究以EDTA為對照。Fe2+鰲合能力用下式表示：

1.5.5 數據處理

用SPSS17.0統計軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 黑米發酵乳對DPPH·的清除能力

將制備的不同稀釋倍數的黑米發酵乳、普通發酵乳的濾液及20%黑米酶解液及VC（0.006mg/mL）對DPPH·清除能力進行測定，其結果如圖1。

圖1 不同樣品對DPPH·的清除活性Fig.1 Scavenging effect of different samples against the DPPH· radical

由圖1可以看出，3種樣品對DPPH·的清除能力與樣品的稀釋倍數成線性關系。未經稀釋時，黑米發酵乳對DPPH·的清除率達到94.51%，而黑米酶解液和普通發酵乳的清除率分別為90.96%和88.01%，隨著稀釋倍數的增加，即樣品濃度的減小，樣品對DPPH·的清除能力減弱。當稀釋到8倍時，黑米發酵乳清除率為60.16%，與濃度為0.006mg/mL的VC清除能力相當（p＞0.05），并且黑米發酵乳與其他兩種樣品清除DPPH·的能力均存在著顯著性差異（p＜0.05）。

2.2 黑米發酵乳對·OH的清除能力

將制備的不同稀釋倍數的黑米發酵乳、普通發酵乳濾液及20%黑米酶解液樣品及VC（6mg/mL）對·OH的清除能力進行測定，同樣三種樣品對·OH的清除能力與樣品的稀釋倍數成線性關系。樣品稀釋8倍時，其清除·OH結果如圖2。

圖2 不同樣品對·OH的清除活性Fig.2 Scavenging effect of different samples against the hydroxyl radical

由圖2可以看出，三種樣品存在不同的·OH清除能力。當樣品稀釋8倍時，黑米發酵乳對·OH清除率30.76%，與濃度為6mg/mL的VC清除能力相當（p＞0.05），其次是20%黑米酶解液21.03%，普通發酵乳18.49%，并且黑米發酵乳與其他兩種樣品清除·OH能力存在顯著性差異（p＜0.05）。

2.3 黑米發酵乳對總抗氧化能力

將制備的不同稀釋倍數的黑米發酵乳、普通發酵乳濾液及20%黑米酶解液樣品及VC（0.15mg/mL）的總抗氧化能力進行測定，同樣三種樣品的總抗氧化能力與樣品的稀釋倍數成線性關系。樣品稀釋8倍時，其總抗氧化能力結果如圖3。

圖3 不同樣品的總抗氧化能力Fig.3 Antioxidant activity of different samples

由圖3可以看出，三種樣品存在一定的總抗氧化能力。當樣品稀釋8倍時，黑米發酵乳的總抗氧化能力最強，為0.847，與濃度為0.15mg/mL的VC清除能力相當（p＞0.05），其次是20%黑米酶解液0.642，普通發酵乳0.466，并且黑米發酵乳與其他兩種樣品總抗氧化能力存在顯著性差異（p＜0.05）。

2.4 黑米發酵乳對Fe2+螯合能力

將制備的不同稀釋倍數的黑米發酵乳、普通發酵乳濾液及20%黑米酶解液樣品及EDTA（0.02mg/mL）對亞鐵離子螯合能力進行測定，同樣三種樣品對Fe2+螯合能力與樣品的稀釋倍數成線性關系。樣品稀釋8倍時，其螯合能力結果如圖4。

圖4 不同樣品的亞鐵離子螯合能力Fig.4 Ferrous ion chelating capacities of different samples

如圖4可以看出，三種樣品存在一定的Fe2+螯合能力。當樣品稀釋8倍時，黑米發酵乳的螯合能力最強，為28.43%，與濃度為0.02mg/mL的EDTA的螯合能力相當（p＞0.05），其次是20%黑米酶解液9.62%，而普通發酵乳的螯合率只有4.51%，黑米發酵乳螯合Fe2+能力接近為它的7倍。

3 討論

對黑米發酵乳、普通發酵乳及20%黑米酶解液三種樣品的體外抗氧化活性進行了研究發現，黑米發酵乳體外抗氧化能力是三種樣品中最強的。其中黑米發酵乳的抗氧化能力比20%黑米酶解液強，說明乳酸菌的發酵能提高黑米酶解液的抗氧化活性；黑米發酵乳的抗氧化能力比普通發酵乳強，尤其是體現在兩者螯合亞鐵離子的能力上，黑米發酵乳是普通發酵乳的7倍，說明黑米中功能性成分發揮了作用。

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In Vitro Study on the Antioxidant Activities of Fermented Black Rice Milk

GUO Fei-xiang，HAN Qing-qing，HUANG Yu-jun，GU Rui-xia*，CHEN Xia，LU Mao-lin
（Jiangsu Province Key Lab of Dairy Biotechnology and Safety Control，College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225127，Jiangsu，China）

Based on the in vitro experiments，the antioxidant activities of fermented black rice milk was studied. The results showed that when fermented black rice milk，ordinary fermented milk and 20% of black rice juice were diluted 8 times，the fermented black rice milk had the most antioxidant activities in three samples.The fermented black rice milk scavenging DPPH，hydroxyl radicals，reducing power and chelating ferrous ion were 60.16%，30.76%，0.847，28.43%and obviously higher than the other samples.It showed that the antioxidant functional composition of black rice and lactic acid bacteria played a synergy and improved the functional characteristics of the fermented black rice milk when they were mixed.

black rice；fermented milk；antioxidant；in vitro

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.002

2012-12-15

江蘇高校優勢學科建設工程資助項目；國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B12）；江蘇省科技支撐項目（BE2011383）；江蘇省高校自然科學研究重大項目(12KJA550003);教育部博士點基金（20093250110005）；青年科學基金項目（31201393）

郭飛翔（1990—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：乳品科學。

*通信作者：顧瑞霞（1963—），男（漢），教授，博士生導師，研究方向：乳品科學。