花楸葉活性成分提取工藝的優化

柴軍紅，何婷婷，金志民，馬懷良，肖杰，張鵬

（牡丹江師范學院，黑龍江牡丹江157011）

花楸葉活性成分提取工藝的優化

柴軍紅，何婷婷，金志民，馬懷良，肖杰，張鵬

（牡丹江師范學院，黑龍江牡丹江157011）

建立花楸葉中黃酮、多糖、萜類同步快速提取工藝，以期為花楸葉活性成分藥用價值開發提供工藝基礎。以花楸葉為原料，以總黃酮、多糖、總萜提取率為技術指標，通過提取方法對比試驗，采用正交設計與多指標綜合分析法（權重）探討提取工藝的影響因素。影響因素順序依次是：超聲波時間＞乙醇濃度＞pH（料液比）＞酶添加量，優化最佳工藝參數：超聲波時間25min，乙醇濃度50%，料液比1∶25（g/mL），pH=4，酶添加量5mg/g。本工藝3種主要指標均比傳統提取法有很大提高，放大20倍實驗表明工藝較為穩定，標準偏差均在3%以內。

花楸葉；黃酮；多糖；萜類；工藝優化

花楸為薔薇科花楸屬植物，常用于治療肺結核、哮喘、咳嗽、胃痛等癥。花楸葉中富含三萜類、甾醇類、黃酮類、胡蘿卜烴類、二聯苯類和木脂素類、生氰苷類、有機酸類、花楸酸及其苷類化合物[1]。除以上各種化合物外，花楸屬植物中還含有烷（醇）類，間苯三酚，D-山梨酸，氨基酸和VC等成分。其中黃酮類、萜類、多糖是主要活性物質，藥理作用上有強抗氧化、抗癌、抗輻射和止咳平喘等作用而引起國內外研究及關注。

以牡丹江產花楸葉（經牡丹江師范學院曲秀春教授鑒定為百花花楸Sorbus pohuashanensis（Hance）Hedl，標本現存于牡丹江師范學院-生命學院標本室）為原料，針對常見工藝提取率低，活性成分收率不穩定，提取率指標單一，不能準確進行工藝評價——因為不同提取方法中活性成分提取率有明顯差異性；同種方法，條件不同對多種活性成分的浸出也存在干擾，所以單一指標是不能準確評價工藝的。為了消除影響，有必要研究多指標工藝對參數的影響，以期為類似藥物提取工藝提供一種新的評價模式。本文采用含量加權法，對總黃酮類、總萜類、多糖等指標加權，利用單因素及正交實驗，研究了花楸葉活性成分提取工藝，獲得較為穩定的提取工藝。

1 材料與方法

1.1.1 主要試劑

苯酚（AR）、濃硫酸（AR）、葡萄糖（AR）：沈陽試劑三廠；工業酒精（98%）、活性碳、纖維素酶（Sigma，C1794）、蘆丁標準品＞99%：貴州迪大生物技術公司；甲醇（AR），三氯甲烷（AR），鹽酸（AR）：沈陽試劑三廠；熊果酸標準品＞98%：貴州迪大生物技術公司；香草醛（AR）：遼寧世星藥化；高氯酸（AR）等，以上未標出試劑為天津大茂化學試劑廠。

1.1.2 主要儀器

HH-6恒溫水浴鍋：金壇市友聯儀器研究所；DZF-6020真空干燥：沈陽林頻實驗設備公司；FZ102植物粉碎機：天津泰斯特儀器公司；UV～2010紫外可見分光光度計（日立），PHS-25型PH計：上海雷磁；BS214D電子天平（德國賽多利斯），RE-52AA旋轉蒸發儀：上海亞榮；SL-2010N超聲波萃取裝置（南京順流），索氏提取裝置；NJL07-3型實驗專用微波爐：南京杰全微波設備有限公司；等。

1.2 提取方法對比試驗

對傳統浸提法，回流提取法，索氏提取法，超聲波輔助法，微波輔助法[2]，纖維素酶輔助法，并對酶法進行了適當組合。以總黃酮、多糖、萜類收率為參數指標，綜合研究確定了提取方法。

具體設置參數為：將自然陰干的花楸葉，粉碎，過20～30目篩，①浸提法采用工業常用參數料液比1∶20（g/mL），70%乙醇，浸泡24 h，回收乙醇濃縮至原體積1/10，定容檢測；②回流提取法：料液比1∶20（g/mL），70%乙醇，回流提取2 h，提取2次合并濾液，回收乙醇濃縮至原體積1/10，定容檢測；③索氏提取同上料液比，乙醇濃度，提取6 h回收乙醇濃縮至原體積1/10定容檢測；④超聲波輔助法依據同樣料液比，乙醇濃度，提取時間30min，溫度30℃，功率100W，頻率20 kHz；⑤微波輔助法：提取時間10min，功率300W，其它條件同上；⑥纖維素酶輔助法溫度37℃，酶解時間0.5 h，酶添加量4mg/g，其它條件同上；⑦酶輔助復合法：具體采用酶解反應時間0.5 h，溫度37℃，其它條件同上；將每組實驗設置平行實驗3次取平均值，結果見表1。

1.3 活性成分測定方法

1.3.1 總黃酮測定方法

采用亞硝酸鈉一硝酸鋁法[3]，在紫外可見分光光度計上，505 nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

樣品含量測定依據1.2方法將提取液回收乙醇，濃縮至原體積1/10，取50%乙醇定容至100mL容量瓶中，移取1mL母液于25mL比色管依據前法測定含量。

1.3.2 多糖測定方法

采用硫酸-苯酚法[4]測定多糖含量。在紫外可見分光光度計上，490 nm處測定吸光值，并繪制標準曲線。

樣品含量測定依據1.2方法將提取液回收乙醇，濃縮至原體積1/10，取50%乙醇定容至100mL容量瓶中，移取2mL母液于25mL比色管依據前法測定含量。

1.3.3 萜類測定方法

此外花楸富含萜類化合物，所以將萜類化合物作為主要成分之一，采用5%香草醛～冰乙酸和高氯酸顯色法[5]，在紫外可見分光光度計上，545 nm波長處測定吸光度值，并繪制標準曲線。

樣品含量測定依據1.2方法將提取液回收乙醇，濃縮至原體積1/10，取50%乙醇定容至100mL容量瓶中，移取1mL母液于25mL比色管依據前法測定含量。

2 結果與討論

2.1 提取方法對比試驗結果

提取方法對比試驗結果見表1。

表1 提取方法對比研究Table1 Comparative Study of Extraction

通過以上實驗表明，傳統的浸提法、回流提取法、索氏提取法對于大極性多糖提取效能較低，加入酶后可以提高提取率6倍以上，對于黃酮與萜類均能提高30%～50%以上，這可能與纖維素酶水解細胞壁，促進胞內物質釋放密切相關。相對來說，超聲波法與微波法均能較好的促進活性物質釋放擴散，是較為節能又快速提取方法，相對有工藝優勢。在相關萃取方法中，若采取酶先處理，將會有更大收率。通過對比，本文將以低溫超聲波法+酶輔助法為提取方法進行討論，至于微波法在其它文章中討論。

2.2 活性成分標準曲線

2.2.1 黃酮標準曲線

依據1.3.1方法建立標準曲線，蘆丁對照品在（0.11～0.67）mg/mL，線性關系良好。其回歸方程為Y= 0.573x+0.016 8，R2=0.999 2。

2.2.2 多糖標準曲線

依據1.3.1方法建立標準曲線，葡萄糖在（2.336～23.356）μg/mL，線性關系良好。其回歸方程為Y= 0.017 5x+0.017 6，R2=0.999 3。

2.2.3 萜類標準曲線

依據1.3.3.方法建立標準曲線，熊果酸對照品在（20～100）μg/mL范圍內呈良好線性關系。其回歸方程為Y=0.005 5x+0.086 7，R2=0.998 4。

2.4 提取因素討論

2.4.1 料液比的影響

將其它參數固定如：酶促溫度37℃，酶促時間為1 h，添加量為4mg/g，pH為5，乙醇濃度60%，超聲波溫度25℃，超聲波時間20min，超聲波頻率20 kHz，功率為200W，料液比設置如下：1∶10；1∶15；1∶20；1∶25；1∶30（g/mL），進行單因素試驗，依據1.3提供的方法測定目標成分含量。其結果如圖1。

圖1 料液比的影響Fig.1 The effect of Feedstock ratio

如圖1所示，在不斷提高料液比時有利于活性成分萃取，但是隨著料液比增大，會對后續過濾，濃縮干燥帶來更多耗能，所以料液比選在1∶20～1∶25（g/mL）范圍較為合理。

2.4.2 酶添加量的影響

取5 g材料依據前面試驗將料液比固定在1∶25（g/mL），酶促溫度設置在37℃，酶促時間設置在1.5 h，將其它參數同上固定，設置酶添加量：8、15、20、25、30 mg。進行單因素試驗，依據1.3提供的方法測定目標成分含量。其結果如圖2。

酶添加量往往需要決定酶促反應速度和程度，實驗表明在當酶添加量達到5mg/g就可以滿足以上工藝需求，同時提取液粘稠度適中過濾較快。

2.4.3 超聲波時間影響

依據前面試驗將料液比固定在1∶25（g/mL），酶促溫度設置在37℃，酶促時間設置在1.5 h，酶添加量5mg/g，將其它參數同上固定，超聲波時間：10、20、25、30、40、45min。進行單因素試驗，依據1.3提供的方法測定目標成分含量。其結果如圖3。

圖2 酶添加量影響Fig.2 The effect of enzyme concentration

圖3 超聲波時間影響Fig.3 The effect of Ultrasonic extraction time

據圖3，在超聲波萃取時間達到20min～30min中將會有一個穩定的收率，但是隨著時間增加黃酮與萜類出現降低，這可能與隨著時間延長多糖和其它水解糖開始團聚，會出現黃酮和萜類吸附，增加其它可能的雜質，最后影響工藝，這一點試驗中采用TLC手段得到了驗證，具體討論另文介紹。

2.4.4 超聲波頻率的影響[6]

依據前面試驗將料液比固定在1∶25（g/mL），酶促溫度設置在37℃，酶促時間設置在1.5 h，酶添加量5mg/g，超聲波時間20min，將其它參數同上固定，超聲波頻率：15、20、25、30、35、40 kHz。進行單因素試驗，依據1.3提供的方法測定目標成分含量。其結果如圖4。

圖4 超聲波頻率的影響Fig.4 The effect of Ultrasonic frequency

超聲波頻率對提取產物種類有不同的影響，為了防止所需要目標產物的流逝，在以上試驗中，發現低頻率對于黏度大的如多糖有很好的萃取能力，對于溶液黏度小的物質適當提高頻率有利于產品萃取，在本工藝中為了達到平衡所以取20 kHz下較為合理。

2.4.5 超聲波功率的影響[7]

依據前面試驗將料液比固定在1∶25（g/mL），酶促溫度設置在37℃，酶促時間設置在1.5 h，酶添加量5mg/g，超聲波時間20min，超聲波頻率20 kHz將其它參數同上固定，超聲波功率：100、200、300、400、500、600W。進行單因素試驗，依據1.3提供的方法測定目標成分含量。其結果如圖5。

圖5 超聲波功率影響Fig.5 The effect of ultrasonic power

超聲波功率在300W下可以較好的兼顧以上三種主要成分，大那是隨著功率加大，熱效應會增強，這樣大分子的如淀粉纖維素會逐步進入溶劑，產生吸附，過濾時會有損失，最后影響主要成分收率，所以無論從能耗或是提取角度都應該選擇較為適中功率。

2.4.6 超聲波溫度影響

依據前面試驗將料液比固定在1∶25（g/mL），酶促溫度設置在37℃，酶促時間設置在1.5 h，酶添加量5mg/g，超聲波時間20min，超聲波頻率20 kHz，超聲波功率300W，將其它參數同上固定，超聲波溫度：30、40、50、60、70、80℃。進行單因素試驗，依據1.3提供的方法測定目標成分含量。其結果如圖6。

圖6 超聲波溫度影響Fig.6 The effect of Ultrasonic temperature

超聲波溫度有好的熱擴散效應，可以促進活性成分釋放[4]，但是隨著溫度升高，雜質將也會增加，并給過濾帶來困難，所以本文提取溫度60℃～70℃之間即可。

2.4.7 pH的影響

依據前面試驗將料液比固定在1∶25（g/mL），酶促溫度設置在37℃，酶促時間設置在1.5 h，酶添加量5mg/g，超聲波時間20min，超聲波頻率20 kHz，超聲波功率300W，超聲波溫度70℃，將其它參數同上固定，溶液pH設置為：3、4、5、6、7、8、9。進行單因素試驗，依據1.3提供的方法測定目標成分含量。其結果如圖7。

圖7 pH的影響Fig.7 The effect of pH

提取時pH對提取產物有很大影響，同時是纖維素酶活性必須條件，如圖7所示，在4～6范圍內有好的收率，隨著pH加大收率下降較快，這與酶最佳pH有關系，也可能與提取物質在不同pH下發生降解有一定關系。所以pH設置在3～6即可滿足工藝要求。

2.4.8 乙醇濃度影響

依據前面試驗將料液比固定在1∶25（g/mL），酶促溫度設置在37℃，酶促時間設置在1.5 h，酶添加量5mg/g，超聲波時間20min，超聲波頻率20 kHz，超聲波功率300W，超聲波溫度70℃，pH4，將其它參數同上固定，萃取劑乙醇濃度為：30%、50%、60%、70%、80%。進行單因素試驗，依據1.3提供的方法測定目標成分含量。其結果如圖8。

圖8 乙醇濃度的影響Fig.8 The effect of ethanol concentration

提取溶劑濃度對目標成分影響很大，這與極性相似相容原理統一。如圖8所示由于多糖極性大，醇溶性差所以低濃度有利于其提取，但是其它成分脂溶性強，為了平衡所以取中間值，本工藝采用40%～50%乙醇濃度為萃取劑。

2.5 正交工藝優化

本試驗是多指標實驗，利用綜合評分法將各項指標加權系數（權值）計算每號試驗結果。加權系數的大小由指標的重要程度來決定，指標越重要加權系數越大[8]。本文依據其提取率多少，將多糖加權100，防止因其提取率較低，數據被抵消不能顯示提取率意義。總黃酮提取率相對較高，活性相對較高若是直接對比多糖進行權值系數的話就和未加權前相似，故與萜類含量相比其權重應該在萜2倍左右較為合理所以總黃酮加權系400，萜類加權系數200。

較選取pH，超聲波時間，酶加入量，乙醇濃度，料液比等為主要因素進行正交設計，選取L18（37），每組實驗平行3次取平均值，采用加權綜合評分，其結果如表2。

表2 正交分析結果Table2 The results of orthogonal analysis

通過R值其所選因素影響是：超聲波時間＞乙醇濃度＞pH（料液比）＞酶添加量，最佳工藝條件是3，4號pH值在3～4范圍內，乙醇濃度50%～60%，料液比1∶25～1∶30（g/mL），酶量5mg/g～6mg/g，工藝上相對來說3號更加符合節能降耗要求，同時由于設置權重會有一定影響，從成分平衡角度出發本文采用3號工藝參數：超聲波時間25min，乙醇濃度50%，料液比1∶25， pH=4，酶添加量5mg/g。

2.6 放大實驗

依據2.5將實驗擴大20倍，每組重復3次，驗證工藝穩定性。其結果如下表3。

表3 工藝穩定性實驗Table3 Stability experim ent

通過穩定性實驗放大20倍后，其重復三次實驗，其黃酮提取率平均值為3.468，標準偏差2.24%，此偏差與偏離算術平均值的程度在3%以內，考慮試驗誤差，表明提取工藝參數較為穩定。同理其多糖、萜類偏差表明，工藝在放大20倍后有好的穩定性。

3 結論

通過對比試驗數據我們可以得到酶促輔助+超聲波提取技術是較為合理且能好溶劑使用量等方面有一定的優勢。通過正交實驗優化和綜合加權分析我們可以明確對于中藥提取僅僅是停留在一個主成分或浸提率上面是不能真正體現中藥價值，同時實驗過程中發現即使高的浸提率并不一定代表活性成分含量高。對于中藥提取的理想狀態是竟可能的提高活性成分，減少無用成分或有毒成分，所以很有必要針對不同藥用部位開展多指標工藝優化及雜質限量控制研究。

總之,本工藝三種主要指標均比傳統提取法有很大提高,放大20倍實驗表明工藝較為穩定,標準偏差均在3%以內,有一定的實踐指導意義。

[1]于民,李銑.花楸屬植物化學成分藥理作用及其研究進展[J].遼寧中醫學院學報,2004,6(5):364-366

[2]王艷,張鐵軍.微波技術在中藥有效成分提取中應用[J].中草藥, 2005,36(3):470-472

[3]曠春桃,李湘洲,汪玉霞，等.大葉冬青葉中總黃酮測定方法和提取工藝研究[J].食品科學,2009,30(6):49-51

[4]孟玲,王蘭英,梁大勇，等.樺褐孔菌多糖測定方法的比較[J].食品研究與開發,2010,31(4):108-111

[5]高茗,胡玉霞,余啟榮，等.UV-Vis法測定靈丹草油中總萜類含量[J].現代中藥研究與實踐,2011,25(1):60-62

[6]郭孝武,林書玉,王蕊娥.不同頻率對提取蕓香苷成分的影響[J].陜西師范大學學報,1996,24(1):50-52

[7]王英張玉剛戴洪義.蘋果果皮中類黃酮的超聲波輔助提取及穩定性研究[J].食品科學,2011,32(11):178-181

[8]林青,林亞平,邱德文.用多指標活動水平的正交設計法對蘇長史茱萸湯提取工藝進行優選[J].中國藥學雜志,2004,39(2):182-184

Optimization of Extraction Process for Active Components from Sorbus Leaves

CHAI Jun-hong，HE Ting-ting，JIN Zhi-min，MA Huai-liang，XIAO Jie，ZHANG Ping
（School of Science and Technology，Mu Dan Jiang Teachers College，Mudanjiang157011，Heilongjiang，China）

To establish simultaneous rapid extraction process for flavonoids，polysaccharides，terpene from Sorbus leaves，it is expected to be promoted to active ingredients of Sorbus leaves to provide technology-based. Sorbus leaves was used as raw material，extraction rate of the total flavonoids，polysaccharides，total terpene are technical Index；comparative study on extraction methods，using orthogonal design and comprehensive analysis of multi-index（weight）to study on the effect of the extraction process.The factors affecting the order is：ultrasonic time＞ethanol concentration＞pH（solid-liquid ratio）＞enzyme added.The Optimal process parameters：ultrasonic time was 25 min，50% ethanol concentration，the ratio of 1∶25（g/mL），pH=4，enzyme added 5 g/g.The three main Technical Index of extraction rate has more greatly improved than the traditional extraction method；the 20-times Amplification experiments show that the process was more stable；standard deviations were less than 3%.

Sorbus leaves；flavonoids；polysaccharides；terpene；optimization of process

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.007

2012-08-21

黑龍江省教育廳科學技術研究面上項目（項目編號：11551514）；黑龍江省教育教學改革項目，校企聯合培養制藥專業實用人才新模式的研究與實踐

柴軍紅（1982—），男（漢），講師，碩士，研究方向：天然產物的分離及應用研究。