貽貝煮汁液酶解工藝的研究

羅偉，段振華，2，*，萬斌，胡靜

（1.海南大學食品學院，海南?？?70228；2.海南大學熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南海口570228）

貽貝煮汁液酶解工藝的研究

羅偉1，段振華1，2，*，萬斌1，胡靜1

（1.海南大學食品學院，海南海口570228；2.海南大學熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南?？?70228）

研究酶法水解貽貝煮汁液的工藝，以水解度和苦味分為指標，比較了1.398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、復合蛋白酶水解貽貝煮汁液的效果，發現木瓜蛋白酶效果最好。在單因素試驗基礎上，以氨基酸態氮含量為響應值，通過Box-Benhnken試驗設計及響應面分析法對影響煮汁液水解的主要因素進行工藝優化，確定貽貝煮汁液酶解最佳條件為：料水比1∶1.5（g/mL）、酶添加量0.76%、溫度50.46℃、pH6.47、時間4 h，該條件下酶解液中氨基酸態氮含量為283.30mg/100mL。

貽貝煮汁；水解；木瓜蛋白酶；氨基酸態氮

貽貝俗稱“海紅”、“殼菜”、“淡菜”，是我國重要的養殖貝類之一[1]。貽貝肉鮮美可口，營養豐富，富含蛋白質，是一種集營養、保健、防病于一體的海產品，具有很高的食療與藥用功效。但在貽貝工業化加工過程中，經蒸煮預處理產生的汁液常常被作為廢棄液排放，既污染環境，又浪費資源。貽貝蒸煮廢棄液富含貽貝水溶性營養成分及生物活性物質。本實驗主要研究貽貝煮汁液的酶法水解，旨在為酶技術應用于貽貝廢棄液深加工生產高附加值的商品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貽貝煮汁液：海南椰島（集團）股份有限公司提供；1.398中性蛋白酶（5×104U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（1.5×105U/g）：廣西杰沃利生物制品有限公司；胰蛋白酶：ICN公司；復合蛋白酶（3.8× 105U/g）：丹麥Novo公司。

氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、硼酸、硫酸鉀、硫酸銅、酚酞、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍指示劑、95%乙醇、甲醛等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HH-S26S電熱恒溫水浴鍋：金壇市大地自動化儀器廠；101-2型電熱鼓風干燥箱：常州市華普達教學儀器有限公司；85-1恒溫磁力攪拌器：金壇市富華儀器有限公司；BS124S電子天平：德國Sartorius公司；PHS-3C型實驗室pH計：上海偉業儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 總氮量及氨基酸態氮測定

總氮量測定：參照GB5009.5—2010凱氏定氮法；氨基酸態氮測定：采用甲醛電位滴定法[2-3]。

1.3.2 水解度[4-5]

1.3.3 苦味評價

參照文獻[6-8]方法。

1.3.4 單因素試驗設計

參考酶的選擇實驗結果，選定木瓜蛋白酶繼續試驗，以氨基酸態氮含量為指標，進行單因素試驗。試驗設計為：加酶量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、酶解溫度（40、45、50、55、60℃）、酶解時間（2、3、4、5、6 h）、pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、料水比g/mL（1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3）。

1.3.5 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，利用響應面法（RSA）優化酶解工藝參數。其因素水平設計見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table1 Factors and levels of the response surface tests

2 結果與分析

2.1 酶的選擇試驗結果

為了比較1.398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、復合蛋白酶水解貽貝煮汁液的效果，以水解度和苦味值為指標，料水比（煮汁液與去離子水體積比）為1∶2（g/mL），酶的添加量為0.4%，在各酶最適作用條件下水解4 h，其最適作用條件根據文獻[9-10]和初步試驗確定，加熱滅酶10min，4 000 r/min離心15min，取上清液分別進行水解度和苦味測定（用于苦味評定的上清液必須滅菌后進行品評）結果見表2。

表2 不同蛋白酶對貽貝煮汁液水解的影響Table2 Hydrolysis influence of different proteases

由表2可見，選用木瓜蛋白酶水解貽貝煮汁液時，蛋白質水解程度高于其他3種酶，且苦味分也較低。因此，決定采用該酶進一步試驗。

2.2 木瓜蛋白酶的單因素試驗

2.2.1 酶用量的選擇

在溫度為50℃，酶解時間為4 h，pH6.5，料水比為1∶2（g/mL）的條件下，加酶量不同，測得氨基酸態氮含量有所差別，見圖1。

圖1 加酶量對氨基酸態氮的影響Fig.1 The effect of amount of enzyme on amino acid-nitrogen（AA-N）

由圖1可看出，當加酶量超過0.7%時，氨基態氮含量基本無明顯升高。此結果可解釋為酶用量在0.7%以下時，底物能被酶作用的位點過量，氨基態氮含量隨酶用量的增加而逐漸升高；然而，當加酶量超過0.7%時，由于酶濃度已逐漸為底物所飽和的原因，導致氨基態氮含量隨加酶量的增加而升高很小[11-12]。所以考慮成本等因素，木瓜蛋白酶添加量取0.7%為宜。

2.2.2 酶解溫度的選擇

在酶的添加量取0.7%，酶解時間為4 h，pH6.5，料水比為1∶2（g/mL）的條件下進行不同溫度的選擇，其水解效果不同，見圖2。

圖2 溫度對氨基酸態氮的影響Fig.2 The effect of temperature on amino acid-nitrogen（AA-N）

由圖2可看出，隨著溫度的升高氨基態氮含量呈先升后降的趨勢，在50℃時氨基態氮含量達到最大值。因此，木瓜蛋白酶的酶解最適溫度在50℃左右為宜。

2.2.3 酶解時間的選擇

在酶加量為0.7%，酶解溫度為50℃，pH6.5，料水比為1∶2（g/mL）的條件下，分別選擇2、3、4、5、6 h進行酶解，見圖3。

由圖3可看出，在初期的1 h內酶解反應迅速，當水解進行3 h左右氨基態氮含量達到最大值；5 h后達到水解平衡，氨基態氮含量基本無明顯變化。所以本研究選擇水解時間為3 h。

圖3 時間對氨基酸態氮的影響Fig.3 The effect of time on amino acid-nitrogen（AA-N）

2.2.4 酶解pH的選擇

在酶加量為0.7%，酶解溫度為50℃，時間為3 h，料水比為1∶2（g/mL）的條件下，分別將pH調節為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，測得氨基酸態氮含量的變化，見圖4。

圖4 pH對氨基酸態氮的影響Fig.4 The effect of pH on amino acid-nitrogen（AA-N）

圖4表明，隨著酶解pH的遞增，氨基態氮含量呈先增后降的趨勢，當pH達到6.5左右時，酶解液中氨基態氮含量達到最大值，這是因為pH會直接影響酶及蛋白質分子的某些解離基團的解離狀態。只有在特定pH條件下，酶及底物蛋白質的解離基團才能處于易于結合并轉化成產物的解離狀態[8]。

2.2.5 料水比的選擇

在酶加量為0.7%，酶解溫度為50℃，時間為3 h，pH6.5的條件下，觀察不同料水比對酶解效果的影響，見圖5。

圖5 料水比對氨基酸態氮的影響Fig.5 The effect of the raw material water on amino acid-nitrogen（AA-N）

由圖5可知，當料水比為1∶1.5（g/mL）時酶解液中氨基態氮含量最高，1∶2時其含量略低，超過1∶2時氨基態氮含量下降較多。其主要原因可能為：酶解體系中加入適量的水，使底物在溶液狀態下有效地與酶結合，從而產生更多氨基態氮；但底物濃度過小時，導致酶濃度降低，氨基態氮含量會下降，不利于反應進行。而且在生產上也不利于酶解液后期的濃縮等工藝要求[13]。所以綜合考慮，選擇料水比為1∶1.5（g/mL）進行研究。

2.3 響應面法優化試驗結果與分析

試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table3 Designs and results of Box-Benhnken experimental（n=5）

方差分析及顯著性比較結果見表4。

利用Design-expert7.0軟件對數據進行回歸分析，對各因素回歸擬合，得到氨基態氮含量Y的回歸方程Y=285.74+1.23X1-0.17X2+0.88X3-2.27X4-1.23X1X2+ 2.10X1X3-0.35X1X4+1.58X2X3-1.23X2X4+2.10X3X4-2.93X12-4.33X22+0.047 X32-4.68X42。同時，優化4個影響因素的最佳組合為：加酶量0.76%，酶解溫度50.46℃，酶解時間4 h，pH為6.47，預測的氨基酸態氮含量為287.65mg/100mL。

表4 氨基酸態氮含量回歸模型方差分析表Table4 Variance analysis of regression equation

由表4可以看出，所得Y的回歸方程極顯著，且失擬項不顯著，說明此模型很理想，用方程Y擬合4個因素與氨基酸態氮含量是可行的。相關系數R2=0.989 6，表明回歸方程與實際數據間具有較好的擬合性；R2Adj= 0.979 3，說明可信度較高。從因素X1、X2、X3、X4對氨基酸態氮含量的影響來看，除方程的一次項X2及二次項X32影響不顯著外，其余因素影響均為極顯著。通過比較方程一次項系數絕對值大小，可以判斷因素影響的主次性[14]，本實驗中因素間影響順序依次為X4＞X1＞X3＞X2；交互項中除X1X4影響不顯著外，其余因素間交互作用對氨基酸態氮含量均達到極顯著（P＜0.01）影響，且各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，而是呈二次關系。

分別將模型中X1、X2、X3及X4其中2個因素固定在0水平，得到另外2個因素間交互作用對氨基酸態氮含量Y的子模型，圖6～圖9為4個因素間部分兩兩交互作用對氨基酸態氮含量影響的響應面分析圖。

為了檢驗模型預測的準確性，在最佳酶解條件：加酶量為0.76%，溫度50.46℃，時間4 h，pH為6.47時進行實驗，測得氨基態氮含量為283.30mg/100mL，與預測值基本接近，表明預測值和真實值間有較好的擬合性，進一步驗證了模型的可靠性。

圖6 加酶量和溫度對氨基酸態氮含量的影響Fig.6 The effect amount of enzyme and temperature on amino acid-nitrogen

圖7 加酶量和時間對氨基酸態氮含量的影響Fig.7 The effect amount of enzyme and times on amino acidnitrogen

圖8 加酶量和pH對氨基酸態氮含量的影響Fig.8 The effect amount of enzyme and pH on amino acidnitrogen

圖9 溫度和pH對氨基酸態氮含量的影響Fig.9 The effect temperature and pH on amino acid-nitrogen

3 結論

以貽貝煮汁液為原料，綜合比較了1.398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、復合蛋白酶酶解液的水解度和苦味評分，選擇木瓜蛋白酶為目標用酶。在單因素試驗結果基礎上，利用響應面分析，建立了氨基酸態氮含量與加酶量、溫度、時間、pH的二次多項回歸模型，其各因素的主要效應關系為：X4（pH）＞X1（加酶量）＞X3（時間）＞X2（溫度），并確定了最佳酶解條件：酶添加量0.76%、溫度50.46℃、pH6.47、時間4 h，此工藝條件下測得平均氨基酸態氮含量為283.30mg/100mL，其與理論值間相對誤差為1.51%。

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Study on Enzymatic Hydrolysis Technology of Mussel Boiled Liquor

LUO Wei1，DUAN Zhen-hua1，2，*，WAN Bin1，HU Jing1
（1.College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China；2.Key Laboratory of Tropical Biological Resources，Ministry of Education，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Enzymatic hydrolysis of mussel boiled liquor was studied in this paper.Firstly，the effects of various enzymatic treatments with neutral protease，papain，trypsin and protamex on bitter taste value and degree of hydrolysis were compared，and the papain was found to be the best.Based on the result of single-factor tests，the amino acid-nitrogen content was chosen as the response values，then Box-Benhnken experimental design and response surface method were used to optimize technological conditions which is as follows：the material-to-water ratio1∶1.5（g/mL），enzyme addition amount of 0.76%，hydrolysis temperature of 50.46℃，hydrolysis pH of 6.47，hydrolysis time of 4h.Under such conditions，the content of amino acid-nitrogen reached283.30mg/100mL.

mussel boiled liquor；hydrolysis；papain；amino acid-nitrogen

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.011

2013-09-23

國家“十二五”科技支撐計劃（2013BAB01B04）；海南省科技興海專項（XH201308）

羅偉（1989—），男（漢），碩士研究生，研究方向：水產品食品科學技術。

*通信作者：段振華（1965—），男（漢），教授，博士，碩導，研究方向：水產食品科學技術。