廣東蟲草深層發(fā)酵及菌絲體成分分析

林群英，李挺，宋斌，李泰輝

（廣東省微生物研究所廣東省菌種保藏與應用重點實驗室廣東省華南應用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東廣州510070）

廣東蟲草深層發(fā)酵及菌絲體成分分析

林群英，李挺，宋斌，李泰輝*

（廣東省微生物研究所廣東省菌種保藏與應用重點實驗室廣東省華南應用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東廣州510070）

對廣東蟲草（Cordyceps guangdongensis）深層發(fā)酵時菌絲體生長規(guī)律和發(fā)酵所獲得的菌絲體成分進行初步的研究與分析。結果顯示，廣東蟲草菌絲體在培養(yǎng)了50 h產量達最大值。溶氧量的下降速度在第30小時開始加快。廣東蟲草菌絲體的蟲草酸含量較高，為46.3mg/g，腺苷為0.25mg/g，胞內粗多糖的含量為3.84%，水解氨基酸總量為26.6%，重金屬含量符合食用菌安全標準。

廣東蟲草；深層發(fā)酵；成分分析

蟲草是一類十分值得開發(fā)的大型真菌資源，不少種類具有良好的抗腫瘤、抗病原、抗氧化以及增強人體免疫功能等多種保健和藥用功效[1]。目前，以冬蟲夏草為代表的蟲草產品價格高，需求量大，為滿足強大的市場需求，有必要加強開發(fā)蟲草的新資源。廣東蟲草（Cordyceps guangdongensis）是作者采集并馴化成功的種類，已實現(xiàn)其子實體的人工栽培[2-3]。液體深層發(fā)酵是食用菌重要的生產方式，具有快速獲得大量產物的優(yōu)點。本文利用發(fā)酵罐對廣東蟲草進行深層液體培養(yǎng)研究，并對所得菌絲體進行成分分析，為規(guī)模化開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

斜面菌種：分離自人工培養(yǎng)的子實體，經純化得母種，轉管繼代培養(yǎng)，25℃下暗培養(yǎng)10 d，再進行光照（10 h/d，400 Lx～500 Lx）培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)基為PDA。

液體菌種：將斜面菌種接種至種子液體培養(yǎng)基YMPD（葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、酵母浸膏3 g、麥芽浸出物3 g/L，pH 6.5）內，25℃下，150 r/min，振蕩培養(yǎng)6 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽浸出物20 g/L，葡萄糖10 g/L，黃豆粉10 g/L，酵母浸膏4 g/L，pH6.5。

40 L的發(fā)酵罐內裝入25 L發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃，滅菌30min，冷卻至室溫后，發(fā)酵培養(yǎng)基體積為22.5 L，備用。

1.2 接種與培養(yǎng)

將液體菌種按10%的接種量接入發(fā)酵罐內，接種后終體積為25L。調節(jié)發(fā)酵罐各參數(shù)，通氣量為8L/min～10 L/min，攪拌速度為180 r/min，溫度（25±1）℃。培養(yǎng)過程中記錄溶氧量和pH等參數(shù)的變化，自發(fā)酵24 h起每隔5小時采一次樣。發(fā)酵至70 h后，終止發(fā)酵培養(yǎng)。1 000 r/min離心10min收集菌絲體，菌絲體在60℃下烘12 h至恒重，稱重。

1.3 成分測定

粗蛋白含量按照GB/T5009.5-2010《食品中蛋白質的測定》第一法測定，換算系數(shù)為6.25[4]；總灰分含量按照GB/T5009.4-2010《食品中灰分的測定》進行測定[5]；水解氨基酸含量按照GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》進行樣品測定[6]；微量元素按照GB/ T5009.11-2003《食品中總砷及無機砷的測定》處理樣品[7]，用IPC-MS法測定[8]；蟲草酸、蟲草素和腺苷含量按林群英等[9]所述方法進行測定；粗多糖含量按照NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的測定》進行測定[10]。

1.4 主要儀器設備

CH-8620WETZIKON發(fā)酵罐：Romabau AG；SXL-1008程控箱式電爐：上海精宏；日立L-8900氨基酸自動分析儀：日本日立公司；島津LC220A高效液相色譜分析儀：島津醫(yī)療器械有限公司；DUR640核酸蛋白分析儀：Beckman公司。

2 結果與分析

2.1 深層發(fā)酵

廣東蟲草深層發(fā)酵生長曲線見圖1。

圖1 廣東蟲草深層發(fā)酵的生長曲線Fig.1 Myceilal growth curve of Cordyceps guangdongensis under submerged culture

廣東蟲草在生長了50 h后達菌絲體干重達最大值10.33 g/L。發(fā)酵過程中，溶氧量和pH的變化情況見圖2。

圖2 廣東蟲草深層發(fā)酵溶氧量和pH變化Fig.2 Changes of concentration of dissolved oxygen and pH values in submerged culture of Cordyceps guangdongensis

隨著菌絲生長的加快，發(fā)酵罐內培養(yǎng)基中的溶氧量一直呈下降的趨勢，至第30小時，下降的速度明顯加快，直到發(fā)酵培養(yǎng)結束仍未出現(xiàn)回升，說明菌絲的生長一直處于耗氧狀態(tài)。發(fā)酵初期，培養(yǎng)基內的pH由開始的6.50升高至7.12，直到第41小時開始回落。由生長曲線可知，從第24至41小時是菌絲生長速率增長最大的階段，隨之進行較平穩(wěn)的生長狀態(tài)，至50 h達到平臺期，生長速率開始出現(xiàn)下降情況（圖2）。

2.2 成分分析

2.2.1 常規(guī)成分

廣東蟲草菌絲體粗蛋白和總灰分的含量分別為40.6%和8.4%，均比子實體的含量（27.5%和3.5%）高[9]。

2.2.2 水解氨基酸

廣東蟲草深層發(fā)酵菌絲體水解氨基酸含量見表1。

表1 廣東蟲草深層發(fā)酵菌絲體水解氨基酸含量Table1 Hydrolytic amino acid contents of Cordyceps guangdongensis mycelium

廣東蟲草菌絲體含有16種氨基酸總和為26.6%，其中7種必需氨基酸總量為9.97%。

2.2.3 維生素

廣東蟲草菌絲體中VB1、VB2和VE的含量分別為0.29、2.03μg/g和434mg/100 g。而VC、VA和VD的含量低于檢測下限。

2.2.4 微量元素

廣東蟲草菌絲體微量元素含量的測定結果見表2。

廣東蟲草菌絲體中錳、鐵、銅、鋅、鎳、硒、鉬和硅8種元素的含量分別為50.5、61.3、11.4、173、3.12、0.35、0.64mg/kg和84mg/kg，其余4種（鉻、鈷、釩和錫）含量低于檢測限量0.5mg/kg。

表2 廣東蟲草菌絲體微量元素含量Table2 Microelement contents of Cordyceps guangdongensis mycelium

2.2.5 有效成分

廣東蟲草菌絲體中蟲草酸和腺苷的含量為46.3mg/g和0.25mg/g，而蟲草素的含量則低于檢測下限。廣東蟲草菌絲體的胞內粗多糖的含量為3.84%。

2.2.6 重金屬

廣東蟲草菌絲體重金屬含量測定結果見表3。

表3 廣東蟲草菌絲體重金屬含量Table3 Heavy metal contents of Cordyceps guangdongensis mycelium

廣東蟲草菌絲體的重金屬含量均在要求限量以下，符合食用菌質量要求。重金屬是食用菌質量檢測的重要指標[11]，分析結果顯示，深層發(fā)酵所得的廣東蟲草菌絲體是安全的。

3 討論

廣東蟲草在培養(yǎng)50 h后菌絲產量達到最大值，為10.33 g/L（約1.0%），稍低于蛹蟲草（C.militaris，1.4%）和古尼蟲草（C.gunnii，1.2%）[12-13]。但各種蟲草有不同的生物學特性，產量稍低并不會對其開發(fā)利用前景產生決定性的影響，而且通過更進一步的研究，廣東蟲草菌絲體產量將得到提高，以滿足實際生產的要求。通過一系列的成分分析證實，廣東蟲草菌絲體的營養(yǎng)成分和有效成分含量與冬蟲夏草等蟲草相近，甚至部分成分比目前已經開發(fā)的種類更高[14-15]。廣東蟲草菌絲體的粗蛋白比古尼蟲草略高（37.3%），蟲草酸的含量遠比古尼蟲草（0.57%）高[16]，有很好的開發(fā)前景。深層發(fā)酵是開發(fā)利用真菌的重要途徑，本文通過小規(guī)模的發(fā)酵罐液體發(fā)酵獲得廣東蟲草菌絲生長的基本數(shù)據(jù)并分析菌絲體的主要成分，為進一步規(guī)模化生產提供重要的參考。

[1]Das SK,Masuda M,Sakurai A,et al.Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris:Current state and prospects[J].Fitoterapia,2010,81(8):961-968

[2]林群英,李泰輝,宋斌,等.廣東蟲草人工栽培的光溫條件研究[J].華南農業(yè)大學學報,2009(1):42-45

[3]Lin QY,Song B,Huang H,et al.Optimization of selected cultivation parameters for Cordyceps guangdongensis[J].Lett Appl Microbiol, 2010,51(2):219-225

[4]衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所,河北省唐山市衛(wèi)生防疫站.GB/ T5009.6-2010食品中蛋白質的測定[S].北京:中國標準出版社, 2010

[5]衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所.GB/T5009.4-2010食品中灰分的測定[S].北京:中國標準出版社,2010

[6]中國預防醫(yī)學科學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所.GB/T 5009.124-2003食品中氨基酸的測定[S].北京:中國標準出版社,2003

[7]四川省食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所,衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所.GB/ T 5009.11-2003食品中總砷及無機砷的測定[S].北京:中國標準出版社,2003

[8]連曉文,楊秀環(huán),梁旭霞.電感耦合等離子體質譜法測定葡萄酒中微量元素[J].理化檢驗:化學分冊,2008,44(11):1108-1111

[9]林群英,李泰輝,宋斌,等.廣東蟲草與冬蟲夏草及蛹蟲草的成分比較[J].食用菌學報,2009,16(4):54-57

[10]農業(yè)部食用菌產品質量監(jiān)督檢驗測試中心(上海),上海市農業(yè)科學院食用菌研究所.NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測定[S].北京:中國農業(yè)出版社,2008

[11]天津市衛(wèi)生局公共衛(wèi)生監(jiān)督所,遼寧省衛(wèi)生監(jiān)督所,四川省食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所,等.GB7096－2003食用菌衛(wèi)生標準[S].北京:中國標準出版社,2003

[12]傅嵐,黃紅英,陳作紅.古尼蟲草液體深層發(fā)酵條件的研究[J].湖南師范大學:自然科學學報,2004,27(2):71-74

[13]李維光,蘇鳳巖,黃榮年.北冬蟲夏草菌絲體噸級液體深層發(fā)酵及生理活性物質的研究[J].微生物學雜志,1997,17(1):32,37

[14]鐘韓,甘莉霞,章衛(wèi)民,等.戴氏蟲草活性成分分析及其對小鼠免疫功能的影響[J].食用菌學報,2008,15(3):55-58

[15]馬冰如,何玲,張甲生,等.蠶蛹蟲草與冬蟲夏草化學成分的比較[J].中國食用菌,1994,13(1):34-37

[16]葉昌秀.古尼蟲草深層發(fā)酵工藝[J].貴州化工,2004,29(5):40-42

Studies on Submerged Culture and Chemical Components of Cordyceps guangdongensis Mycelial

LIN Qun-ying，LI Ting，SONG Bin，LI Tai-hui*
（Guangdong Institute of Microbiology，State Key Laboratory of Applied Microbiology in South China（Ministry-Province Co-Construction），Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application，Guangdong Open Laboratory of Applied Technology，Guangzhou 510070，Guangdong，China）

Preliminary studies on submerged culture and mycelial chemical components of Cordyceps guangdongensis were performed.Mycelial biomass of Cordyceps guangdongensis reached to highest after incubating for 50 h.The mycelium contained cordycepic acid at 46.3 mg/g，adenosine 0.25mg/g，polysaccharides 3.84% and total amino acids26.6%.The contents of heavy metals were under the levels in standard for edible mushrooms.

Cordyceps guangdongensis；submerged culture；component analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.023

2012-10-23

廣東省自然基金項目（No.10451007002006249）；廣東省科技計劃項目（No.2010B020304005）；廣州市科技計劃項目（2007Z3-E0511）

林群英（1979—），女（漢），助理研究員，博士，研究方向：食用菌研究與開發(fā)。

*