錐栗SRAP反應體系的建立與優化

向 暉 ，袁德義 ，b，賈寶光

（中南林業科技大學a. 經濟林育種與栽培國家林業局重點實驗室；b.經濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

錐栗Castanea henryi（Skan） Rehd. et Wils.為我國特有種[1]，屬殼斗科栗屬植物，俗稱榛子，主要分布在我國長江以南的福建、浙江、湖南等近14個省區內。錐栗營養豐富，具有健脾胃、補腎強體等功用[2]，其主干通直，材質堅實，耐水濕，被廣泛應用于建筑、造船、家具制造等行業[3]，具有很好的經濟價值和利用前景[4]。目前，關于錐栗的研究多限于資源調查、新品種培育、果實性狀分析等方面，可對錐栗分子生物學方面的研究報道卻較少[3]，而利用SRAP分子標記技術對錐栗進行的研究還未見諸報道。

SRAP（Sequence Related Amplified Polymorphism，相關序列擴增多態性）技術是美國加州大學蔬菜作物系的 Li 與 Quiros[5]于 2001 年在蕓薹屬植物中開發出來的，是一種基于PCR 的新型分子標記技術。它主要通過獨特的引物設計對開放閱讀框（ORFs）進行擴增[6]，通過上下游引物的結合，可同時對外顯子、內含子和啟動子區域進行擴增，且能擴增出特異性[7]。因為不同個體或物種的內含子、啟動子和間隔序列不同，故其擴增的多態性高[8-9]；同時，SRAP所需 DNA 的量少而純度低，操作簡單且重復性好[10]。因此，本研究采用單因素試驗與正交試驗相結合的研究方法，對錐栗的SRAP反應體系進行了優化試驗，以期為進一步研究錐栗種質資源的遺傳多樣性及分子輔助育種奠定基礎，也為其他物種的相關研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試樣品采自不同野生錐栗單株剛萌發的嫩葉，硅膠保存帶回實驗室，再置于－80 ℃的低溫冰箱中保存以備用。樣品信息見表1。

1.2 主要試劑及儀器

PCR擴增所需的Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）、10XPCR Buffer（含Mg2+15 mmol/L）均購自TaKaRa生物工程有限公司；DNA marker（DL5000） 購自Solarbio科技有限公司；電泳所用Tris、 瓊脂糖等主要試劑均為國產分析純。SRAP引物由華大基因公司合成，所用引物序列有Me2、Me3、Me5、Em1、Em2、Em4，引物信息詳見表2。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.3 試驗方法

1.3.1 錐栗總DNA的提取與檢測

樣品總DNA的提取采用改良的CTAB法[11-12]，試劑盒由天根生化科技有限公司提供，按盒內說明書步驟提取DNA。產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度，最后將DNA濃度稀釋至10 ng/μL，于－20 ℃的冰箱中保存。

1.3.2 SRAP基礎體系及擴增程序

參照Li等人[5]開發設計的 SRAP 擴增體系及程序，隨機選擇樣品1號與引物Me2- Em1組合進行擴增。

基礎體系為：總體系 20 μL，包括 10 ng/μL 模板 DNA 4 μL，5 U/μL Taq 酶 0.2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，10×Taq Buffer 2 μL，10 μmol/L 的上游引物、下游引物各 1 μL， ddH2O 10.2 μL。

擴增程序為： 94 ℃預變性 5 min；94 ℃、1 min，35 ℃ 、1 min，72 ℃、1 min，共5個循環；94 ℃、1 min，50 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共 35 個循環；72 ℃再延伸10 min，于4 ℃下保存。

1.3.3 SRAP體系單因素優化試驗設計

參照基礎體系，設8個試驗水平（即8個濃度梯度），就不同濃度的模板DNA、Taq 酶、Mg2+、引物、dNTP對SRAP-PCR反應結果的影響情況進行了單因素試驗，以優化基礎反應體系，從而找出各因素的最佳反應參數。其總體系為20 μL，各影響因子的濃度梯度如表3所示。

表3 SRAP體系優化單因素試驗設計Table 3 Design of single factor test for SRAP-PCR system optimization

1.3.4 SRAP體系正交優化試驗設計

參照單因素優化試驗得到的最優反應參數，對模板DNA濃度、Taq 酶濃度、Mg2+濃度、dNTP 濃度、引物濃度這5 個因素進行了4 個水平的L16（45）正交優化試驗，試驗設3次重復，正交試驗設計分別見表4與表5。再將正交試驗結果與單因素試驗結果進行對比分析，最終選出了適合錐栗的SRAP最優反應體系。

表4 SRAP反應體系的試驗因素與水平Table 4 Factors and levels of SRAP-PCR reaction system

表5 SRAP體系優化正交試驗設計L16(45)Table 5 Orthogonal design L16(45) of SRAP-PCR system optimization

1.3.5 產物檢測

將PCR 擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓110 V，電泳 30～40 min，Gelstain 核酸凝膠染料染色， 置于凝膠成像系統上觀察拍照。

1.4 錐栗SRAP最優反應體系穩定性的檢測

隨機抽取5個模板（2～6號）和2個引物組合（即Me3-Em2與Me5-Em4），對最終確定的錐栗SRAP最優反應體系的穩定性進行了檢測。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 模板DNA濃度對SRAP-PCR反應結果的影響

DNA作為PCR反應的模板，是體外擴增反應的基礎。模板濃度過低或過高都會影響擴增試驗的結果：濃度過低，擴增產物不穩定或無擴增產物；濃度過高可能增加非特異性產物[13]。模板DNA濃度對SRAP-PCR反應結果的影響情況如圖1 所示。由圖1可知，模板濃度的變化對錐栗SRAP反應的影響不大。20 μL體系中，DNA含量在5～100 ng之間，均可擴增出條帶，但在10 ng以下和85 ng以上時，擴增出的條帶模糊，條帶數少； 處于25～70 ng之間的條帶穩定，條帶數多且清晰可辨。結合穩定度與樣品用量等方面考慮，初步選擇模板DNA含量的最適濃度為40 ng。

圖1 模板DNA濃度對SRAP-PCR反應結果的影響Fig. 1 Effect of template DNA concentration on SRAP-PCR

2.1.2 Taq DNA聚合酶濃度對SRAP-PCR反應結果的影響

Taq DNA聚合酶濃度對PCR擴增有著顯著的影響。濃度過低影響新鏈合成效率，甚至無法擴增；濃度過高則易造成浪費，產生非特異性條帶。本試驗設置了1.0～4.5 U 8個梯度以觀測TaqDNA聚合酶濃度對錐栗SRAP-PCR反應結果的影響情況，試驗結果如圖2 所示。從圖2中可以看出，Taq酶含量在2.5 U以下時，擴增效果較好；其含量超過2.5 U時，擴增出的條帶既模糊又不穩定。綜合考慮試驗結果和經濟因素，初步選定的20 μL體系中Taq DNA聚合酶的最適濃度為2.0 U。

圖2 Taq DNA聚合酶濃度對SRAP-PCR反應結果的影響Fig. 2 Effect of Taq DNA polymerase concentration on SRAP-PCR

2.1.3 Mg2+濃度對SRAP-PCR反應結果的影響

作為Taq酶的輔助因子，Mg2+濃度不僅影響Taq酶活性，還能與反應液中的dNTP、模板DNA及引物結合，影響引物與模板的結合效率和模板與PCR產物的解鏈溫度以及產物的特異性和引物二聚體的形成[14]。Mg2+濃度對SRAP-PCR反應結果的影響情況如圖3 所示。圖3顯示，當Mg2+濃度為1.4～2.8 mmol/L時，Mg2+濃度對錐栗SRAP反應結果的影響不明顯；當其濃度＞2.4 mmol/L時，擴增出的條帶數減少；當其濃度超出2.8 mmol/L時，幾乎無法擴增出條帶；而當其濃度為1.8 mmol/L時，擴增效果最好。

2.1.4 dNTP濃度對SRAP-PCR反應結果的影響

圖3 Mg2+濃度對SRAP-PCR反應結果的影響Fig. 3 Effect of Mg2+ concentration on SRAP-PCR

dNTPs與DNA一樣，是PCR擴增的基礎，作為原料參與新鏈DNA的合成，對PCR反應有著十分顯著的影響。dNTPs濃度過高會使堿基錯配率和實驗成本增加；而其濃度過低則影響合成效率，產量下降，甚至導致產物單鏈化。因此，適宜的dNTP濃度對PCR反應至關重要。dNTP濃度對SRAP-PCR反應結果的影響情況如圖4 所示。由圖4可知，當dNTP濃度低于0.16 mmol/L時，擴增出的條帶亮度明顯下降；當其濃度低于0.1 mmol/L時，擴增出的條帶數量減少且模糊不清；而其濃度為0.16～0.28 mmol/L時，擴增效果區別不大，條帶明亮清晰。本試驗初步選定的最適于錐栗SRAP反應的dNTP濃度為0.25 mmol/L。

2.1.5 引物濃度對SRAP-PCR反應結果的影響

圖4 dNTP濃度對SRAP-PCR反應結果的影響Fig. 4 Effect of dNTP concentration on SRAP-PCR

引物與DNA模板特異性結合，引導新鏈的合成，在PCR擴增中，起著十分重要的作用。引物濃度關系到擴增產物的質量，濃度偏高會引起錯配和非特異性產物擴增，增加引物二聚體的形成幾率；濃度太低則無法進行有效擴增[15]。試驗設置8個引物梯度，結果如圖5所示。在引物濃度為0.3～1.0 μmol/L區間內，均能擴增出條帶，且其多態性好，但濃度低于0.5 μmol/L和大于0.9 μmol/L時，條帶黯淡不清晰。因此，在保證條帶穩定且清晰的前提下，最適于錐栗SRAP反應的引物濃度可為0.6 μmol/L。

2.2 正交試驗結果的直觀分析

L16（45）正交試驗的電泳結果如圖6所示。按照遺傳多樣性分析要求，參考何正文等人[16]的方法，對PCR擴增結果從高到低依次打分。總分16分，條帶數量豐富、清晰度高，背景低的最佳產物記為16分，與此相反，最差的則記為1分。3次重復試驗獨立評分，結果見表5。根據得分平均值求出每個因素同一水平下的試驗值之和Ki（即ΣKi，i＝1,2,3,4）以及每一因素水平下的數據平均值Ki（即Ki＝Ki/4），并求出同一因素不同水平間平均值的極差R值（即R＝Kmax－Kmin，Kmax為單個試驗因素中Ki的最大值；Kmin為單個試驗因素中Ki的最小值），結果見表6。

圖5 引物濃度對SRAP-PCR反應結果的影響Fig. 5 Effect of primer concentration on SRAP-PCR

圖6 正交試驗擴增結果Fig. 6 Amplification results of orthogonal test

表 6 正交結果的直觀分析Table 6 Intuitive analysis of orthogonal result

結合圖6與表5分析，處理組合1、2、7、14的得分很低，條帶效果不理想。其中處理組合1、2的條帶量少且黯淡，擴增產物少，其原因是模板、Taq酶濃度、dNTP濃度比較低，新鏈合成效率不高；處理組合7的條帶量較少，其原因是Mg2+濃度過高，影響了Taq DNA聚合酶的活性，同時dNTP濃度低，影響了產物的合成；處理組合14條帶少，這可能因為模板和引物濃度過高，而Taq酶濃度和dNTP濃度又過低。參考表5的評分，綜合3次重復試驗結果，考慮穩定性、條帶數、條帶亮度及清晰度，初步選擇處理組合15為最適反應體系。

對正交試驗結果進行直觀分析得出，影響錐栗SRAP反應結果的5個重要因素為模板DNA濃度、Taq 酶濃度、Mg2+濃度、dNTP 濃度、引物濃度，這5個因素對PCR反應結果的影響效力存在明顯差異。極差R值反映了每個因素對SRAP反應的影響程度，R值越大，表示該因素對試驗結果影響越顯著[15]。表6說明，RdNTP濃度＞RTaq酶濃度＞R引物濃度＞RMg2+濃度＞R模板濃度，即影響因子dNTP濃度對錐栗SRAP反應結果的影響最大，其次為Taq酶濃度，對其影響最小的是模板DNA濃度。Ki值反映了各因素不同水平對反應體系的影響情況，Ki值越大，表示對應的梯度水平越好，對反應體系的影響效果越佳。各試驗因素不同試驗水平對錐栗SRAP反應結果的影響情況如圖7 所示。由圖7可知，模板DNA濃度的最佳水平為40 ng，Taq酶濃度的最佳水平為2.0 U，Mg2+濃度的最佳水平為1.8 mmol/L，dNTP濃度的最佳水平為0.28 mmol/L，引物濃度的最佳水平為0.8 μmol/L。但由此得出的5因素的最佳水平組合，在正交設計表中并沒有出現。另一方面，正交設計中得分最高的處理組合15，與此最佳組合十分接近，兩者只有模板DNA濃度與引物濃度不一致，而極差R值說明，這兩個因素對錐栗SRAP反應結果的影響并不大，因此，綜合比較分析之前的單因素試驗結果，最終確定的錐栗SRAP-PCR反應最佳體系為：20 μL體系中，模板DNA濃度40 ng，Taq酶濃度2.0 U，Mg2+濃度1.8 mmol/L，dNTP濃度0.28 mmol/L，引物濃度 0.6 μmol/L。

圖7 各試驗因素不同試驗水平對錐栗SRAP反應結果的影響Fig. 7 Effects of different test levels of each test factor on SRAP-PCR in C. henryi

2.3 最優體系穩定性檢測

隨機抽取5個模板與2個引物組合對最終確定的錐栗SRAP最優反應體系的穩定性進行檢測，結果如圖8所示。圖8中，編號為1～5的試驗所用引物組合為Me3- Em2，所用模板依次為模板2、模板3、模板4、模板5、模板6；編號為6～10的試驗所用引物組合為Me5- Em4，所用模板依次為模板2、模板3、模板4、模板5、模板6。擴增產物條帶豐富、清晰可辨，穩定重復性好，表明最終優化后的該體系適用于錐栗SRAP分子標記試驗。

3 討 論

圖8 錐栗SRAP最優反應體系穩定性檢測結果Fig. 8 Test result of stability of the optimal SRAP-PCR system in C. henryi

SRAP是一種基于PCR的新型分子標記技術，由美國加州大學蔬菜系的兩位博士Li和Quiros于2001年在發表的Springer-Verlag雜志中提出[5]，其操作簡單，重復性好，具有高頻率的共顯性，且不需要預知物種的序列信息，擴增條帶多態性和信息量豐富，易于分離測序[10]。與其他分子標記技術相比，RAPD存在重復性和穩定性較差，SSR檢測的位點較少、引物開發費時且成本高，AFLP分析程序復雜、成本昂貴等問題。而SRAP彌補了上述各項標記的不足，并以其獨有的優點已成為一種比較理想的分子標記技術[17]。目前，SRAP技術已成功運用于甜菜[18]、色蕉[19]、牡丹[20-21]、野牛草[22]、甜瓜[10]、水稻、馬鈴薯、萵苣、白菜、大豆、油菜、大蒜、蘋果、生菜、柑橘、櫻桃、芹菜等植物的研究中[23-24]，但還沒有人將此標記方法應用于錐栗研究中。因此，建立一套錐栗SRAP-PCR反應最優體系，可為錐栗的后續分子生物學研究奠定基礎。

雖然SRAP技術已廣泛應用于其他植物的研究中，但同樣的方法在不同植物中的應用會有差異，如鄭婷婷[25]、郭大龍[26]、史紅麗[27]、徐穎[28]等人的研究結果均不同。由此可見，對錐栗進行SRAP反應體系的優化試驗是十分必要的。

當前，常見的分子標記體系的優化方法主要有兩種：一種是單因素試驗法；一種是正交試驗法。兩種方法各有利弊。單因素試驗設計簡單，操作誤差小[29]，可快速而又直觀地表現出各因子對反應體系的影響情況，但不能體現出各因素之間的互作效應[13]。正交試驗可以很好地反映出各影響因素之間的互作效應，具有布點均衡、試驗次數少、結果直觀等優點[30]，但對其結果的評價往往帶有主觀性，試驗結果直接受評分高低的影響，缺乏一定的可靠度。因此，本試驗采用單因素試驗與正交試驗相結合的方法進行綜合分析，可揚長避短，能更有效、更準確地得出錐栗SRAP最優反應體系，保證體系的穩定性。

本研究分析得出，PCR的影響因素之間并不是獨立而是相互起作用的，但各因素的影響力度不一樣。DNA與dNTP一樣，是PCR擴增的基礎。dNTP濃度過高會增加堿基的錯配率；其濃度過低則影響合成效率，甚至導致產物單鏈化。但是，試驗結果表明，錐栗SRAP反應對DNA的要求不高，而對dNTP濃度的要求嚴格。另一方面，Mg2+作為Taq酶活性的影響因子，不僅干擾Taq酶參與反應的效率，還能與其他影響因子結合，從而影響反應進程。而文中的試驗結果表明，Mg2+濃度在1.4～2.8 mmol/L 的范圍內時，其對反應的影響不大，因此，此濃度范圍是適合錐栗SRAP標記的。比較兩種分析方法，單因素試驗中，Taq酶濃度和dNTP濃度對PCR擴增的影響較大，而模板DNA濃度的影響較?。徽辉囼炛?，根據極差R值同樣可以得出，影響較大的因素仍是dNTP濃度和Taq酶濃度，其次是引物濃度，模板濃度的影響最小，這與單因素試驗結果高度一致。相比其他植物而言[31-33]，采用兩種方法研究的結果高度一致的情況并不多見，這在一定程度上也凸顯了錐栗的特殊性，以及不同物種試驗前體系優化的必要性。在具體的試驗因素與水平上，單因素試驗分析所得的模板濃度、引物濃度、dNTP濃度和正交試驗分析所得的結果并不完全一致，這可能與PCR反應本身的不穩定性和主觀評分有關，由于兩種方法的結果在總體趨勢上保持高度一致，因而具體試驗因素與水平的差異并不影響最終結果的準確性與可靠度，最終優化體系的驗證試驗也證實了此結論。最后，本研究得出的最優體系組合，即 20 μL體系中，模板DNA濃度40 ng，Taq酶濃度 2.0 U，Mg2+濃度 1.8 mmol/L，dNTP濃度0.28 mmol/L，引物濃度0.6 μmol/L，可為錐栗進一步的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構建、親緣關系及種質資源的鑒定與研究奠定了基礎，也為其他物種的分子標記研究提供了理論參考。

[1] 郎 萍,黃宏文.栗屬中國特有種居群的遺傳多樣性及地域差異[J].植物學報,1999,41(6):651－657.

[2] 孔沈魯,陳錦權.錐栗貯藏溫度對淀粉降解速率的影響[J].農業工程學報,2004,20(5):222－224.

[3] 劉國彬,龔榜初,羅正榮.錐栗自然居群 ISSR-PCR 分析技術的建立[J].果樹學報,2009,26(1):103－107.

[4] 潘超然,鮑世利,陳錦權.錐栗貯藏過程維生素C的降解速率以及保鮮條件研究[J].農業工程學報,2003,19(6):234－237.

[5] Li G, Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism(SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction:Its application to mapping and gene tagging inBrassica[J].Theoretical and Applied Genetics,2001,103:455－461.

[6] 彭邵峰,張黨權,陳永忠,等.14個油茶良種遺傳多樣性的SRAP分析[J].中南林業科技大學學報,2011,31(1):80－85.

[7] M A Espo′sito, E A Martin, V P Cravero,et al.Characterization of pea accessions by SRAP’s markers[J].Scientia Horticu Lturae,2007,113:329－333.

[8] 祝全東,張黨權,李曉云,等.油茶SRAP標記的PCR體系建立與優化[J].中南林業科技大學學報,2010,30(3):57－62.

[9] 韓 欣,張黨權,王志平,等.基于SRAP的贛南油茶良種分子鑒別研究[J].中南林業科技大學學報,2012,32(3):147－151.

[10] Ferriol M, Pico B, Nuez F. Genetic diversity of a germplasm collection ofCucurbita pepousing SRAP and AFLP markers[J].Theor Appl Genet, 2003,107(2): 271－282.

[11] 黃少勇,張智俊,羅淑萍,等.山核桃EST-SSR引物的篩選及通用性分析[J].經濟林研究,2013,31(3):10－15.

[12] 張建英,毛向紅,張瑩瑩.利用RAMP分子標記對酸棗資源的遺傳多樣性分析[J].經濟林研究,2014,32(2):14－18.

[13] 郭凌飛,鄒明宏,曾 輝,等.澳洲堅果ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J].林業科學,2008,44(5):160－164.

[14] 曾艷玲,謝 鵬,謝耀堅,等.桉樹ISSR-PCR反應體系的建立及優化[J].中南林業科技大學學報,2008,28(1):44－48.

[15] 穆立薔,劉贏男,馮富娟,等.紫椴ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J].林業科學,2006,42(6):26－31.

[16] 何正文,劉運生,陳立華.正交設計直觀分析法優化PCR條件[J].湖南醫科大學學報,1998,23(4):403－404.

[17] 陳 罡,吳立國.SRAP 標記及其在林木遺傳育種研究中的應用前景[J].遼寧林業科技,2009,(6):48－51.

[18] Nevena N L, John W, Robert L. Detection of DNA polymorphism in sugarbeet bulks by SRAP and RAPD markers[J]. Journal of Biotechnology, 2007, (Supplement): 131－132.

[19] Youssef M, James A C, Rivera M R,et al. Musa genetic diversity revealed by SRAP and AFLP[J]. Molecular Biotechnology, 2011,47(3): 189－199.

[20] Han Xiao-yan, Wang Liang-sheng, Liu Zheng-an,et al.Characterization of sequence-related amplified polymorphism markers analysis of tree peony bud sports[J]. Scientia Horticulturae, 2008, 115:261－267.

[21] Han Xiao-yan, Wang Liang-sheng, Shu Qing-yan,et al.Molecular characterization of tree peony germplasm using Sequence-Related Amplified Polymorphism markers[J].Biochemical Genetics, 2008, 46:162－179.

[22] Budak H, Shearman R C, Parmaksiz I,et al. Molecular characterization of buffalo grass germplasm using sequencerelated amplified polymorphism markers[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2004, 108:328－334.

[23] Xiaoming Wu, Xiaohua Qi, Mingfang Zhang,et al. Molecular phylogeny of Chinese vegetable mustard (Brassica juncea) based on the internal transcribed spacers (ITS) of nuclear ribosomal DNA[J]. Genet Resour Crop Evol, 2007, 54: 1709－1716.

[24] 李 嚴, 張春慶. 西瓜雜交種遺傳多態性的 SRAP 標記分析[J]. 園藝學報, 2005, 32(4):643－647.

[25] 鄭婷婷,林 萍,王開良,等.油茶SRAP-PCR反應體系的優化[J].林業科學研究,2010,23(2):302－307.

[26] 郭大龍,羅正榮.部分柿屬植物 SRAP- PCR 反應體系的優化[J].果樹學報,2006,23(1):138－141.

[27] 史紅麗,韓明玉,趙彩平.桃SRAP-PCR反應體系的建立與優化[J].華北農學報,2008,23(增刊):201－204.

[28] 徐 穎,韓 影,趙巍巍,等.山梨 SRAP 反應體系的建立[J].湖北農業科學,2010,49(1):24－26.

[29] 邱 帥,丁信譽,席夢利,等.東方百合 SRAP 體系優化及引物篩選[J].南京林業大學學報,2013,37(3):6－10.

[30] 姜榮波,姜景民,劉 軍,等.紅楠ISSR-PCR反應體系的建立和優化[J].林業科學研究,2011,24(2):194－199.

[31] 方 攀,張運城,袁虎威,等.樟子松SSR反應體系優化[J].基因組學與應用生物學,2013,32(3):413－419.

[32] 李 鵬,汪陽東,陳益存,等.油桐ISSR-PCR最佳反應體系的建立[J].林業科學研究,2008,21(2):194－199.

[33] 陳亮明,相 陽,張冬林,等.兩種方法對廣玉蘭ISSR-PCR反應體系的優化比較[J].種子,2008,27(6):10－14.