超聲波結合CMC-Na對馬血中血紅素提取工藝效果影響

代文婷，陶永霞，楊海燕，白羽嘉，馮作山*

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052)

血紅素廣泛存在于動物的血液、肌肉和某些植物組織中，是一類重要的含鐵天然卟啉化合物[1]，在食品、醫藥、化工、保健品等行業中有廣泛的用途。在食品工業中，血紅素可替代發色劑亞硝酸鹽及人工合成色素加入火腿、灌腸等食品中，所得制品切面色澤均勻、鮮艷美觀，保持肌肉固有的天然色彩，且口感韌性強、味道純正，也降低了亞硝酸鹽對人體的危害[2,3]；在醫藥行業中，血紅素不僅是半合成法制備膽紅素的前體，而且是制備抗癌、抗炎藥物的重要原料[4,5]；人體對血紅素鐵的吸收率是無機鐵的3倍[6]，在臨床醫學中，血紅素常用作高效的補鐵劑，可治療因缺鐵引起的貧血癥[7,8]。

對血紅素的提取已有相關報道，多以豬血、牛血、雞血等畜禽血為原料進行提取。新疆擁有豐富的馬種資源，但其開發利用深度不夠，未能體現出獨特的價值。本研究以馬血為原料，采用超聲波結合CMC-Na提取血紅素，并選用Box-Behnken設計試驗和響應曲面法分析試驗結果，最終得到馬血血紅素的最佳提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

新鮮馬血購買于新疆瑪納斯縣屠宰場；血紅素標準品（純度98% ）Sigma公司；檸檬酸三鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、CMC-Na等均為分析純 天津市盛淼精細化工有限公司。

JY 92-IIN 超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；JJ-2 增力電動攪拌器 江蘇省金壇市醫療儀器廠；FA2104N電子分析天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；YY3009000型換膜式過濾器 美國Millipore公司；XX8200115型蠕動泵美國Millipore公司；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；FE20型pH計 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超聲波結合CMC-Na提取馬血血紅素

試驗在王超英[9]的基礎上，進行工藝改進，得到提取的工藝流程：新鮮馬血→加入檸檬酸三鈉 (8g/L)抗凝[10]→攪拌→4000r/min離心10min分離RBC→RBC中加入0.9%的生理鹽水離心兩次→加入去離子水溶血，攪拌均勻→超聲波破碎→調溶液pH值，使之達到珠蛋白和血紅素分離的最佳值，并連續攪拌2h→膜分離（流速1.7m/s，壓力 0.05MPa）→調節溶液 pH值→加入 CMC-Na(1.2%)懸浮液吸附，連續攪拌 2h提取血紅素→高速離心，分離出血紅素→洗滌，干燥→血紅素。

1.2.2 血紅素產率計算公式[11]：

血紅素總含量/g=提取樣品總質量×樣品中血紅素純度

式中：m 為稱取樣品的質量；V 為血紅素溶液體積，即100mL。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 超聲功率對血紅素產率的影響

RBC投料量為50mL，超聲時間為10min、去離子水的添加量為RBC的5倍、提取pH為5.5、CMC-Na添加量為10mL的條件下，考察超聲功率分別為195、260、325、390W時對血紅素產率的影響。

1.2.3.2 超聲時間對血紅素產率的影響

RBC投料量為50mL，超聲功率為325W、去離子水的添加量為RBC的5倍、提取pH為5.5、CMC-Na添加量為10mL的條件下，考察超聲時間分別為5、10、15、20min時對血紅素產率的影響。

對于有單獨公豬舍的豬場，應想法使公豬舍的室溫保持在13℃～20℃，或者把公豬放入后備舍或妊娠母豬舍以維持公豬需要的適宜溫度，減輕降溫對公豬的影響。

1.2.3.3 去離子水的添加量對血紅素產率的影響

RBC投料量為50mL，超聲功率為325W、超聲時間為10min、提取pH為5.5、CMC-Na添加量為10mL的條件下，考察去離子水的添加量分別為RBC體積的2、3、4、5、6、7倍時對血紅素產率的影響。

1.2.3.4 提取pH對血紅素產率的影響

RBC投料量為50mL，超聲功率為325W、超聲時間為10min、去離子水的添加量為RBC的5倍，CMC-Na添加量為10mL的條件下，考察提取pH分別為4.5、5、5.5、6時對血紅素產率的影響。

1.2.3.5 CMC-Na的添加量對血紅素產率的影響

RBC投料量為50mL，超聲功率為325W、超聲時間為10min、去離子水的添加量為RBC的5倍，提取pH為5.5的條件下，考察CMC-Na的添加量分別為5、10、15、20、25mL時對血紅素產率的影響。

1.2.4 響應曲面設計試驗

根據單因素試驗結果，利用Design-Expert 8.06軟件進行響應曲面設計，優化血紅素的提取工藝。試驗設計如下：

表1 響應面分析因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

超聲功率對血紅素產率的影響結果見圖1。

圖1 超聲功率對血紅素產率的影響Fig.1 The influence of ultrasonic power on the yield of heme

由圖1可知，超聲功率對血紅素產率的影響比較顯著，隨超聲功率的不斷增加，血紅素的產率呈先上升后下降的趨勢，當超聲功率調至325W時，血紅素產率達到最大值；當超聲功率大于325W時，血紅素產率呈下降趨勢，可能是因為超聲波空化效應雖有助于紅細胞破碎，但隨其強度增大及超聲還引起一定的化學反應導致血紅蛋白變性凝聚[12,13]，致使血紅素的釋放受阻，進而影響了血紅素的產率。綜合考慮生產過程中的各種因素，超聲波功率設定為325W。

2.1.2 超聲時間對血紅素產率的影響

超聲時間對血紅素產率的影響結果見圖2。

圖2 超聲時間對血紅素產率的影響Fig.2 The influence of ultrasonic time on the yield of heme

由圖2可知，超聲時間對血紅素產率影響較大，隨超聲時間的增加，血紅素的產率呈先上升后下降的趨勢，在10min時達到峰值，隨超聲時間的延長，產率開始下降。產生此現象可能是因為超聲達到一定值后，空化趨于飽和，再延長超聲時間會產生大量無用氣泡，降低了空化強度，進而影響了血紅素的產率。綜合考慮實際生產中各種因素，超聲波時間選擇10min比較適宜。

2.1.3 去離子水的添加量對血紅素產率的影響

去離子水的添加量對血紅素產率的影響結果見圖3。

圖3 V去離子水/VRBC對血紅素產率的影響Fig.3 The influence of deionized water/RBC (v/v) on the yield of heme

由圖3可知，去離子水添加量對血紅素提取影響較大，產率隨去離子水添加量的增加，呈先上升后下降的趨勢。當去離子水的添加量為RBC的5倍時，產率達到最大值，而后開始緩慢下降。這種現象可能是隨去離子水的添加，紅細胞內外滲透壓差逐漸增大，紅細胞吸水致細胞膜脹裂，利于其中血紅蛋白的釋放，但達到峰值后再繼續增加去離子水的體積，整個提取液的濃度降低，一定程度上抑制了CMC-Na對血紅素的吸附。所以綜合考慮實際生產中各種因素，選取去離子水的添加量為RBC體積的5倍比較適宜。

2.1.4 提取pH對血紅素產率的影響

提取pH對血紅素產率的影響結果見圖4。

圖4 提取pH對血紅素產率的影響Fig.4 The influence of extraction pH on the yield of heme

由圖4可知，提取pH對血紅素產率有一定影響，隨提取pH值的增大，血紅素產率呈先上升后下降的趨勢。當提取液pH為5.5時達到峰值。這種現象可能是由于血紅素卟啉對脂質雙分子層有親和作用，當pH值在4.0～6.0時，卟啉與脂質雙分子層摻和量最小，此時卟啉分布率最高，故提取液的pH值選取5.5較適宜。

2.1.5 CMC-Na添加量對血紅素產率的影響

CMC-Na添加量對血紅素產率的影響結果見圖5。

圖5 CMC-Na添加量對血紅素產率的影響Fig.5 The influence of amount of CMC-Na on the yield of heme

由圖知，血紅素產率隨CMC-Na添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，當添加量為10mL時達到峰值。經方差分析，添加量對血紅素產率沒有顯著性影響（P>0.05），因此在響應曲面試驗設計中不再把CMC-Na添加量作為一個因素考慮。

2.2 響應曲面設計試驗結果

2.2.1 響應曲面結果分析

表2 試驗設計與結果Table 2 Trial design and results

利用Design-Expert 8.06軟件對試驗數據進行回歸擬合，建立血紅素產率與以上四個因素的二次多項回歸模型：

表3 響應面試驗方差分析Table 3 Variance analysis of the response surface test

注：**.P<0.01，差異極顯著；*.P<0.05，差異顯著。

對回歸模型進行方差分析，模型P<0.01，表明回歸模型極顯著；模型的一次項A、B、C均極顯著，D不顯著；二次項均極顯著；交互項BC極顯著，AB、AC、AD、BD和CD均不顯著。以上表明，各因素對血紅素產率的影響不是簡單的線性關系。失擬項P=0.4236＞0.05不顯著，相關系數R2=0.9637，說明模型擬合程度良好，可用來分析和預測超聲波結合CMC-Na提取血紅素的結果。四因素對血紅素產率的影響順序為：超聲功率＞V去離子水/VRBC＞超聲時間＞提取pH。

2.2.2 因素間的交互作用

采用Design Expert 8.06軟件分析并繪制響應面圖，如圖6-圖11所示。

圖6 超聲功率與超聲時間對血紅素產率交互影響的響應面分析圖Fig.6 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic power and ultrasonic time

圖7 超聲功率與去離子水和RBC體積比對血紅素產率交互影響的響應面分析圖Fig.7 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic power and deionized water/RBC (v/v)

圖8 超聲功率與提取pH對血紅素產率交互影響的響應面分析圖Fig.8 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic power and extraction pH

圖9 超聲時間與去離子水和RBC體積比對血紅素產率交互影響的響應面分析圖Fig.9 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic time and deionized water/RBC (v/v)

圖10 超聲時間與提取pH對血紅素產率交互影響的響應面分析圖Fig.10 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic time andextraction pH

圖11 去離子水和RBC體積比與提取pH對血紅素產率交互影響的響應面分析圖Fig.11 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of deionized water/RBC (v/v) and extraction pH

2.2.3 驗證試驗

經分析，最適條件值為超聲功率336.24W、超聲時間9.33min、去離子水的添加量是RBC的5.15倍、提取pH5.51，在此條件下血紅素的預測產率約為0.42g/50mL。考慮到實際操作的便利，將提取工藝修正：超聲功率為338W、超聲時間為10min、去離子水的添加量是RBC體積的5倍、提取pH為5.5。采用修正后的工藝參數進行3次平行驗證試驗。血紅素產率分別為0.42、0.43、0.41g/50mL，血紅素產率試驗均值為0.42g/50mL，與模型預測值相差不大，可見該模型可以較好地反映出超聲波結合CMC-Na提取血紅素的條件。

3 結論

在單因素試驗基礎上，通過Design-Expert軟件，采用Box-Behnken 試驗設計法對超聲波結合CMC-Na提取馬血中血紅素工藝進行設計并優化，建立了提取血紅素的二次多項數學模型，優化了提取工藝條件，得出最佳工藝條件：超聲功率為338W、超聲時間為10min、去離子水的添加量是RBC的5倍、提取pH為5.5時，血紅素產率達到最大值0.42 g/50mL，與預測值0.42g/50mL基本一致，說明響應面法適用于對超聲結合CMC-Na提取馬血血紅素進行參數優化。

[1] 瞿桂香, 黃耀江, 董明盛. 血紅素制備工藝研究進展[J]. 中央民族大學學報,2007,16(1):19-22.

[2] 莊紅，張鐵華，林松毅，等.血紅蛋白中二價鐵離子保護研究進展[J].食品科學，2006，27（12）：901-903.

[3] Hawwm Oshima，Sadi Yamada. A Simple and Rapid Method for Determination of Heme and Nonheme Irons in Food[J]. Toxica1，Environ，Health，1993，39（2）：114-120.

[4] 鐘耀廣，南慶賢. 國內外畜血研究動態[J]. 中國農業科技導報，2003，5（3）：26-29.

[5] Hu W，Link H，Lang W. Preparation，purification and characterization of chlorohaemin[J]. Biol Chem Hoppe Seyler，1992，373（6）：305-306.

[6] 羅章，鄭立紅. 血紅素色素制取及在肉品加工中的應用[J].中國農業科技導報，2006，8（1）：40-42.

[7] 郭月紅，李洪軍，廖洪波，等.肉類食品防腐保鮮技術的研究進展[J]. 肉品工業，2005，（2）：30-32.

[8] Van Moeseke W，De Smet S，Claeys E，et al . Very fast chilling of beef：effects on meat quality[J]. Meat Science，2001，59（1）：31-37.

[9] 王超英. CMC血紅素的制備[J].杭州教育學院學報.2002，19（3）：54-55.

[10] 王連鵬，張立娟，吳明文，等.動物血液抗凝效果的影響因素探討[J]. 肉類工業，2010（4）：19-20.

[11] 葛靜微，羅均，李小定，等.響應面分析法優化血紅素提取工藝[J].食品科學，2010，31（8）：60-64.

[12] Daniels S，Kodama T，Price DJ. Damage to red blood cells induced by acoustic cavitation[J].Ultrasound in Med Biol，1995，21（1）：105-111.

[13] 周麗珍，李冰，李琳，等.超聲非熱處理因素對細菌效果的影響[J].食品科學，2006，27（12）：54-57.