豬胎兒成纖維細胞的分離與基因轉染

于永生，曹 陽，羅曉彤，張立春，金海國，王曉陽

(吉林省農科院畜牧分院，吉林 公主嶺 136100)

中國是世界上養豬規模最大的國家，但豬生產水平遠低于歐美養豬發達國家[1]。短期內傳統的育種手段很難在豬生產性能方面取得大的進展，轉基因動物為豬遺傳育種提供了新的技術手段，可大大加速遺傳改良的速度，尤其是轉基因體細胞核移植技術的出現，為轉基因技術在豬改良育種中的應用提供了技術支撐。綠色熒光蛋白（Green-fluorescent protein,GFP）cDNA由 Prasher等在維多利亞水母（Aequorea Victoria）中克隆獲得[2]，該蛋白在一定波長的紫外光下呈現綠色熒光，可作為標記蛋白用于生物學研究，尤其是由于可直觀表現表達效果，而在轉基因動物研究領域中廣泛應用[3-6]。

表達GFP的轉基因豬由Park等采用核移植方法在2001年獲取[7]，隨后韓國的2個實驗室也分別獲取了GFP轉基因豬[8-9]。國內東北農業大學劉忠華研究團隊于2007年也獲得了國內首批GFP轉基因豬[10]。

本文利用組織塊貼壁法獲取豬胎兒成纖維細胞，通過脂質體介導的轉基因技術獲得了表達綠色熒光蛋白的轉基因細胞，為建立利用核移植技術獲取轉基因豬的技術平臺奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

懷孕35 d的大白豬來源于吉林省農業科學院畜牧分院種豬場，手術法采集子宮，置于37℃PBS中，1 h內運送至實驗室；熒光蛋白真核表達質粒pEGFP-C1為本實驗室保存。

1.2 豬胎兒成纖維細胞的分離培養

用滅菌剪刀剖開子宮，取出胎兒，利用添加抗生素的37℃ PBS洗滌至少3遍，置于無菌平皿中，去除頭、四肢、內臟，將剩余的軀干轉移到另外的滅菌安瓿瓶中，利用滅菌眼科剪將組織剪碎至糊狀，將其涂布到細胞培養皿底部，置于38℃、飽和濕度的CO2培養箱中放置4h后，小心加入細胞培養液（DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗+1%非必需氨基酸），盡量避免組織塊漂浮，繼續以上述條件進行培養，每72h換液一次，在第9 d左右成纖維樣細胞開始從組織塊孵出，利用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，進行傳代。

1.3 豬胎兒成纖維細胞生長曲線測定

用0.25%胰蛋白酶消化傳至第三代的豬胎兒成纖維細胞，將細胞懸液與等量0.5%臺盼藍混合染色，利用細胞計數板進行活細胞計數，利用細胞培養液將活細胞濃度調整為2×104/mL，接種至24孔細胞培養板，每孔接種量為0.5 mL，將細胞培養板置于38℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養箱中培養。每24 h利用細胞計數板計數3個孔中的活細胞數目，計算平均活細胞數，利用Excel繪制生長曲線。

1.4 豬胎兒成纖維細胞最小致死濃度測定

將傳至第三代的豬胎兒成纖維細胞按每孔接種2×105細胞的量接種到24孔板的6個孔，24 h 后換液,分別用終濃度為 0、200、400、600、800、1000μg/mL的G418進行處理,每72h換液1次,培養9 d后所有細胞均凋亡的G418濃度,就是G418對豬胎兒成纖維細胞的最小致死濃度。

1.5 豬胎兒成纖維細胞的轉染

將傳至第三代的豬胎兒成纖維細胞接種至6孔板中，利用不添加雙抗的細胞培養液進行培養，待生長至80%匯合時，按照脂質體2000說明書的方法進行基因轉染，每孔用脂質體10μL，質粒4μg。轉染18 h后利用含最小致死濃度的G418的細胞培養液進行篩選，每72 h換液一次。

1.6 轉基因細胞的鑒定

篩選9 d后，利用熒光顯微鏡觀察細胞是否具有熒光，同時利用0.25%胰蛋白酶消化部分細胞，蛋白酶K（150μg/mL）消化后用兩倍體積的無水乙醇（含0.075M的氯化鈉）沉降DNA，利用引物P1和P2，PCR檢測外源基因的整合。引物序列如表1所示。

表1 PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 組織塊法分離培養豬胎兒成纖維細胞

貼壁的組織塊培養3 d后僅有少量成纖維細胞從組織塊邊緣游離出，接種9 d后，組織塊周圍即可長出大量成纖維細胞(圖1A)。利用胰蛋白酶傳代，傳代后的細胞呈梭形，生長旺盛(圖1B)。

圖1 豬胚胎成纖維細胞分離培養

2.2 細胞生長曲線的測定

每天對24孔板中的3個孔進行活細胞計數，繪制細胞生長曲線（圖2），可以發現細胞生長趨勢為：細胞生長滯留期為0～1 d，對數生長期為2～4 d，5 d后進入平臺期。

圖2 豬胎兒成纖維細胞生長曲線圖

2.3 G418對豬胎兒成纖維細胞最小致死濃度的確定

以6個不同濃度的G418處理豬胎兒成纖維細胞,觀測細胞形態，發現600μg/mL的G418處理9 d后可使豬胎兒成纖維細胞全部死亡，因此在篩選轉基因細胞時采用的G418濃度為600μg/mL。

2.4 轉基因細胞的鑒定

對篩選得到的轉基因細胞提取DNA，利用PCR對外源基因的整合進行鑒定，結果顯示，可檢測到預期片段(圖3)，說明外源基因有效整合到細胞基因組。

圖3 GFP轉基因細胞和克隆胚胎DNA檢測結果

在熒光顯微鏡下，可以看到篩選得到的細胞大多可表達綠色熒光蛋白（圖4），說明外源基因得到有效表達。

圖4 GFP轉基因豬成纖維細胞（200x）

3 討論

目前豬胎兒成纖維細胞的分離主要采用兩種方法：蛋白酶消化法和組織塊法。前者是先用蛋白酶對組織塊進行消化，經過篩網過濾后，細胞懸液接種到細胞培養皿(瓶)，經過3～5 d培養獲得原代細胞，該方法需要時間短，但蛋白酶消化程度不好把握，容易對分離的細胞增殖造成一定影響；后者是把組織剪碎后接種到培養皿（瓶）壁，當組織周圍孵出的細胞形成單層時，消化這些單層細胞即可獲得原代細胞，該方法獲得的細胞增殖能力比較穩定，但需要的時間長。綜合考慮利弊，本文采用組織塊貼壁法進行豬胎兒成纖維細胞的分離，通過9 d組織塊貼壁培養，最終獲得了形態正常的豬原代胎兒成纖維細胞。傳至第三代，繪制的細胞生長曲線顯示，接種第一天細胞處于恢復期，細胞數量有所下降，因為部分細胞死亡。從第二天開始細胞恢復旺盛的增殖分裂，進入對數生長期，5 d后進入平臺期，細胞鋪滿培養皿，隨后由于細胞相互接觸，生長受到抑制。該結果與李仕新等采用酶聯檢測儀測定OD值法繪制的蛋白酶消化法分離的豬胎兒成纖維細胞的生長曲線的實驗結果不一致，該研究小組結果顯示豬胎兒成纖維細胞于生長初期1～6 d呈對數增長，此后進入平臺期，差異可能是由于細胞分離方法以及生長曲線繪制方法不同而造成[7]。豬胎兒成纖維細胞的分離為進一步的基因轉染奠定了基礎。

轉基因細胞一般采用脂質體介導轉染法、電擊法、鈣沉淀法、病毒介導法進行獲取。電擊法往往適用于所轉移的片段比較大、細胞轉染率低等情況；鈣離子沉淀法需要對鈣離子濃度進行精密控制，不易操作且實驗重復性差；病毒介導法具有轉基因效率高的特點，但考慮到安全性，往往在以獲取轉基因動物為目的的研究中應用不多；脂質體法主要利用帶正電荷的陽離子脂質體與帶負電荷的DNA片段結合，進而將DNA導入細胞膜脂質雙分子層內，從而完成轉基因，目前脂質體法已經在豬、牛、羊等動物細胞轉基因方面得到應用。綜合考慮上述的轉基因方法，本項目采用脂質體介導的轉基因技術進行基因導入，按脂質體10μL：熒光蛋白質粒4μg的比例對六孔板中的細胞進行轉染，由于熒光蛋白質粒上帶有neo基因，一旦整合到細胞中，可表達neo蛋白，有效抵抗G418對細胞的危害，因此可用G418對轉染后的細胞進行篩選，經過600μg/mL的G418的篩選，最終得到轉基因細胞，PCR檢測熒光蛋白基因得到有效整合，熒光檢測顯示，所獲取的細胞大多可表達綠色熒光蛋白，說明外源基因得到有效表達，所得轉基因細胞可以作為生產轉綠色熒光蛋白豬的核移植供體細胞，為下一步通過核移植方法獲得轉基因“熒光豬”奠定了基礎。

[1]熊遠著 .中國養豬業發展道路[J].中國豬業，2006（4）：1-4.

[2]Prasher DC,Eckenrode VK,Ward WW,et al.Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein[J].Gene,1992,111(2):229-233.

[3]Takada T,Iida K,Awaji T.Selective production of transgenic mice using green fluorescent protein as a marker[J].Nat Biotechnol,1997,15(5):458-461.

[4]Koo BC,Kwon MS,Roh JY,et al.Quantitative analysis of tetracycline-inducible expression of the green fluorescent protein gene in transgenic chickens[J].J Reprod Dev,2012,58(6):672-677.

[5]Lin F,Liu Q,Li M,et al.Transient and stable GFP expression in germ cells by the vasa regulatory sequences from the red seabream (Pagrus major)[J].Int J Biol Sci,2012,8(6):882-890.

[6]Murakami T,Kobayashi E.GFP-transgenic animals for in vivo imaging:rats,rabbits,and pigs[J].Methods Mol Biol,2012(872):177-189.

[7]Park K W,Cheong H T,Lai L,et al.Production of nuclear transfer-derived swine that express the enhanced green fluorescent protein[J].Anim Biotechnol,2001(12):173-181.

[8]Hyun S,Lee G,Kim D,et al.Production of nuclear transfer-derived piglets using porcine fetal fibroblasts transfected with the enhanced green fluorescent protein[J].Biol Reprod,2003(69):1060-1068.

[9]Lee G S,Kim H S,Hyun S H,et al.Production of transgenic cloned piglets from genetically transformed fetal fibroblasts selected by green fluorescent protein [J].Theriogenology,2005(63):973-991.

[10]劉忠華，宋 軍，王振坤，等.體細胞核移植生產綠色熒光蛋白轉基因豬[J].科學通報，2008，53（5）：556-560.

[11]李仕新，陳松玲，李加琪，等.長大二元雜交豬胎兒成纖維細胞的生物學特性 [J].四川農業大學學報，2012，30(2):220-225.

[12]李景芬，于 浩，袁 野，等 .同源重組敲除MSTN基因的豬胎兒成纖維細胞的構建 [J].中國農業科學，2009，42(8)：2972-2977.

[13]于永生，羅曉彤，張立春，等.牛胎兒成纖維細胞的分離培養及轉染線蟲ω-3脂肪酸去飽和酶基因 [J].中國農學通報，2011，27（23）：12-16.

[14]王彥鳳，梁 燕，金 永，等 .克隆內蒙古白絨山羊胸腺素β4基因并穩定轉染胎兒成纖維細胞 [J].中國農業科學，2010，43(21)：4497-4504.