密蒙花黃色素性質研究

楊勝遠，李卓文，賴演蓮，方曉旋，陳曉屏，楊娜

（韓山師范學院生物學系，廣東潮州521041）

密蒙花黃色素性質研究

楊勝遠，李卓文，賴演蓮，方曉旋，陳曉屏，楊娜

（韓山師范學院生物學系，廣東潮州521041）

對密蒙花黃色素的性質進行了研究。結果表明，密蒙花黃色素易溶于水，難溶于石油醚，在不同溶劑中的溶解性為水＞無水乙醇＞丙酮＞石油醚。密蒙花黃色素在4、30℃、pH4.92～9.18范圍內穩定，但高溫、光和EDTA對其色價有一定影響。密蒙花黃色素具有較強DPPH自由基清除能力，每毫克密蒙花黃色素與10.01μg Trolox自由基清除能力相當。在10 g/L的濃度下，密蒙花黃色素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、副溶血性弧菌、釀酒酵母、匍枝根霉、黑曲霉和桔青霉均沒有抗菌活性。

密蒙花；黃色素；性質

食用色素主要用于改善食品色調和色澤，在提高食品感官品質、增進食欲等方面具有重要作用。合成色素具有品質均一、色澤鮮艷、著色力強、穩定性好、無臭無味、易于溶解和拼色的優點，在食品加工業曾被廣泛采用，然而合成色素具有潛在危險性，一些國家相繼制定了一系列限制合成色素使用的法規，發達國家則禁止使用合成色素。因此，亟待開發安全性高的天然食用色素。

密蒙花（Buddleja officinalis Maxim）別名黃飯花、小錦花、蒙花、疙瘩皮樹花、雞骨頭花、羊耳朵等，為雙子葉植物藥馬錢科（Loganiaceae）醉魚草屬（Buddleja）植物密蒙花的花序，分布于福建、廣東、廣西、湖南、安徽、湖北、四川、貴州、云南、陜西、甘肅等地，含有豐富的黃酮類化合物和藏紅花甙，有清肝利尿、明目退熱、抗菌消炎、鎮靜止咳之功效[1-2]，在中國西南壯族、布依族、傣族及漢族地區常用它作食品染色劑，以其制作的黃色米飯色澤鮮亮、自然，具有密蒙花花朵的清香[3]。民間的長期食用實踐和現代毒理學研究[4]均表明密蒙花黃色素具有極高的安全性，是一種最有希望的天然植物黃色素。

本文旨在對密蒙花黃色素的性質進行探討，以期為密蒙花黃色素的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

密蒙花花序采自廣西田林縣潞城鎮，曬干后備用；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、黑曲霉（Aspergillus niger）和桔青霉（Penicillium citrinum）均為韓山師范學院食品與發酵研究所保藏菌種；2，2–二苯基–1–苦肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH），奎諾二甲基丙烯酸酯（（±）-6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid，Trolox），購自美國Sigma公司，編號分別為D9132和238813；其余化學藥品或試劑均為國產分析純試劑。

1.2 儀器

UV-2450紫外-可見分光光度計：日本Shimadzu公司生產。

1.3 培養基

細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基[5]；霉菌采用PDA培養基[5]；酵母采用YPD培養基[6]；副溶血性弧菌采用3％氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）[7]。

1.4 方法

1.4.1 原料處理

將密蒙花花序的花于50℃熱風烘干，粉碎后過60目篩密閉保存。

1.4.2 密蒙花黃色素的制備

稱取密蒙花10 g于圓底燒瓶中，加入70％乙醇200mL，在瓶口接上冷凝管，然后于60℃冷凝回流浸提15min，冷卻后減壓抽濾，濾液于55℃旋轉蒸發濃縮后進行冷凍干燥，置于變色硅膠干燥器恢復至常溫備用。

1.4.3 密蒙花黃色素色價測定

參照文獻[8]修改后進行測定。稱取待測天然色素樣品0.1 g，用50％乙醇溶解并定容至100mL，然后以50％乙醇進行適當稀釋，再用1 cm比色皿，以50％乙醇溶液做參比，于435 nm測定稀釋液的吸光值A，然后按①式進行計算色價：

式中：E1cm435 nm為密蒙花黃色素在435 nm處測定的色價，（U/g）；A為密蒙花黃色素稀釋液在435 nm處的吸收值；V為密蒙花黃色素溶液的體積，mL；f為密蒙花黃色素溶液的稀釋倍數；m為密蒙花黃色素的質量，g。

1.4.4 密蒙花黃色素溶解性

稱取100mg黃色素于帶塞試管，分別加入1mL蒸餾水、無水乙醇、丙酮、石油醚，旋渦混勻2min，常溫放置30min，觀察溶解情況。

1.4.5 光線對密蒙花黃色素穩定性的影響

將密蒙花黃色素溶于蒸餾水配制成1 g/L溶液，于4℃冰箱保存，間隔5天取樣，適當稀釋后于435 nm測定吸收值A，并換算為色價。

1.4.6 溫度對密蒙花黃色素穩定性的影響

將密蒙花黃色素溶于蒸餾水配制成濃度為1 g/L溶液，分別于4、30、80℃保溫，間隔2 h取樣，適當稀釋后于435 nm測定吸收值A，并換算為色價。

1.4.7 pH對密蒙花黃色素穩定性的影響

將密蒙花黃色素分別溶于蒸餾水、pH4.92和pH9.18磷酸鹽緩沖液（1/15mol/L）配制成濃度為1 g/L溶液，于80℃保溫，間隔2 h取樣，用相應溶劑進行適當稀釋，然后以相應溶劑作為參比于435 nm測定吸收值A，并換算為色價。

1.4.8 EDTA對密蒙花黃色素穩定性的影響

將密蒙花黃色素溶于蒸餾水配制成濃度為1 g/L溶液，分別取40mL與10mL蒸餾水、10mLEDTA溶液（500mg/L）混勻，于4℃冰箱保存，間隔5 d取樣，適當稀釋后于435 nm測定吸收值A，并換算為色價。

1.4.9 密蒙花黃色素清除DPPH自由基活性測定

DPPH自由基清除實驗加樣情況見表1。

表1 DPPH自由基清除實驗加樣表Table1 Sample table of radical DPPH·scavenging activity assay

參照文獻[9]略作修改后進行測定。用蒸餾水配制1 g/L密蒙花黃色素溶液，用50％乙醇配制200μmol/L DPPH溶液和濃度分別為20、40、60、80、100μmol/L的Trolox溶液，然后按表1加樣，加入DPPH液之后，常溫反應在20min，測定520 nm的吸光值A。

通過（2）式計算Trolox溶液和密蒙花黃色素樣品液的自由基清除率，以Trolox濃度為橫坐標，自由基清除率為縱坐標繪制標準工作曲線。通過計算得到的密蒙花黃色素樣品液的自由基清除率，在標準曲線上找出其相對應的Trolox濃度，可換算成Trolox當量（μg/mg），表述為每毫克密蒙花黃色素（干基）相當于Trolox的微克數。

1.4.10 密蒙花黃色素抗菌活性測定

將密蒙花黃色素配制成10 g/L水溶液，然后采用管碟法[10]測定其對靶菌的抑菌活性。用游標卡尺測抑菌圈的直徑，以抑菌圈直徑表示抗菌活性。供試靶細菌、酵母及霉菌孢子密度均大于108CFU/mL，細菌于37℃培養24 h，酵母和霉菌于30℃培養60 h。

2 結果

2.1 密蒙花黃色素溶解性

經對密蒙花黃色素在不同溶劑中的溶解性進行考察，結果表明：100mg密蒙花黃色素在1mL不同溶劑中溶解程度為水＞無水乙醇＞丙酮＞石油醚，黃色素易溶于水，全部溶解，而在石油醚中幾乎不溶，石油醚無黃色。該結果與文獻[11]研究結果相符。

2.2 光線對密蒙花黃色素穩定性的影響

光線對密蒙花黃色素穩定性的影響見圖1。

圖1 光對密蒙花黃色素穩定性的影響Fig.1 Effect of light on the stability of Buddleja officinalis yellow pigments

將密蒙花黃色素水溶液（pH為4.79）于自然光下貯存（4℃），結果密蒙花黃色素在前5天，色價有所下降，然后趨于穩定（圖1）。

文獻[11]研究表明密蒙花黃色素在pH4～7時對自然光穩定，而文獻[12]認為密蒙花黃色素溶液在pH7.0和pH9.0時對日光具有較高的穩定性，但在pH4.0時對日光的穩定性較差。本文結果與文獻[11-12]略有差異，可能由于密蒙花黃色素中的不同成分對光的穩定性不一致，因此出現色價先降后穩定的現象。

2.3 溫度對密蒙花黃色素穩定性的影響

溫度對密蒙花黃色素穩定性的影響見圖2。

圖2溫度對密蒙花黃色素穩定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of Buddleja officinalis yellow pigments

圖2 顯示，4℃和30℃保藏的密蒙花黃色素的色價基本不變，但80℃處理的黃色素隨著保溫時間延長，色價逐漸降低，說明高溫對密蒙花黃色素的穩定性有一定影響。

文獻[12]表明密蒙花黃色素在80℃以下時穩定，100℃處理對黃色素穩定性有一定影響，但色素殘存率仍有95.5％，與圖2結果不符，這是由于文獻[12]只保溫2h，處理時間較短所造成。文獻[11]考察了不同溫度對密蒙花黃色素的穩定性，認為在測試溫度下溫度對色素性能的影響甚微，色素對溫度變化有一定的耐受力，其結論也與本研究結果有差異。從文獻[11]的結果可見隨著在40℃～80℃保溫時間延長，黃色素的吸收值也逐步下降，但由于文獻[11]也只在不同溫度下處理3 h，因此吸光度的變異系數不大。

2.4 pH對密蒙花黃色素穩定性的影響

pH對密蒙花黃色素穩定性的影響見圖3。

圖3 pH對密蒙花黃色素穩定性的影響Fig.3 Effect of pH on the stability of Buddleja officinalis yellow pigments

結果表明，經80℃處理，不同pH的密蒙花黃色素的色價都隨著處理時間增加而下降，而且下降的速度基本一致，說明色價下降是由溫度造成，而pH對密蒙花黃色素的穩定性基本沒有影響。

2.5 EDTA對密蒙花黃色素穩定性的影響

EDTA對密蒙花黃色素穩定性的影響見圖4。

圖4 EDTA對密蒙花黃色素穩定性的影響Fig.4 Effect of EDTA on the stability of Buddleja officinalis yellow pigments

結果表明，隨著保藏時間增加，添加EDTA的黃色素溶液的色價逐漸下降，而無EDTA存在的黃色素溶液的色價在45 d內基本不變，說明EDTA對密蒙花黃色素色價有一定影響。

文獻[11]表明CuSO4對密蒙花黃色素有一定協同作用，AlCl3可降低黃色素的吸收值，但變異系數不大；文獻[12]表明NaCl和AlCl3對密蒙花黃色素的色澤影響不大，但FeCl3影響較大。EDTA能絡合金屬離子，常用于防止金屬離子對色素的影響，但圖4結果表明EDTA對密蒙花黃色素的穩定性有一定影響，因此不適宜在密蒙花黃色素中使用。為了預防Fe3+對密蒙花黃色素的影響，應從Fe3+介入途徑加以控制較為適宜。

2.6 密蒙花黃色素清除DPPH自由基活性

密蒙花中存在多種黃酮類化合物，如刺槐素、芹菜素、木犀草素、密蒙花新甙、蒙花甙、木犀草素-7-O-葡萄糖甙和秋英甙[13]，黃酮類化合物具有較好的抗氧化活性。文獻[14]對密蒙花總黃酮進行了研究，表明密蒙花對DPPH自由基清除作用比VC強，文獻[15]也表明密蒙花總黃酮具有羥自由基的清除作用和對羥自由基誘發卵磷脂脂質過氧化具有抑制作用。

經對密蒙花黃色素清除DPPH自由基活性進行測定，結果密蒙花黃色素溶液（1 g/L）對DPPH自由基具有一定清除能力，自由基清除率為81.11％，每mg密蒙花黃色素與10.01μg Trolox的DPPH自由基清除能力相當。研究結果表明密蒙花黃色素具有較強的自由基清除能力，與文獻[13-15]相符，說明在黃色素提取過程中，密蒙花大部分總黃酮已被提取出來，因此密蒙花黃色素的使用以粗提物較好，無需純化。

2.7 密蒙花黃色素抗菌活性測定

文獻[16]表明密蒙花總黃酮和總苯乙醇甙在細胞水平上有明顯的抗菌（金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌）活性，其活性成分為密蒙花甙和洋丁香甙，文獻[17]以拓撲異構酶Ⅳ為靶點，對中藥密蒙花的化學成分（包括單體化合物和提取分離有效部位和流分）進行抗菌活性篩選，結果顯示石油醚部位、醋酸乙酯部位、大孔樹脂40％乙醇洗脫部位和單體成分芹菜素、異洋丁香甙、密蒙花甙、洋丁香甙以及songaroside A對拓撲異構酶Ⅳ有較強的抑制作用。

經對10 g/L密蒙花黃色素水溶液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、副溶血性弧菌、釀酒酵母、匍枝根霉、黑曲霉和桔青霉的抗菌活性進行測定，結果表明密蒙花黃色素水溶液對測試菌株均沒有抗菌活性。

3 討論

密蒙花是我國西南各省民間用來制作黃色米飯的傳統藥食兩用植物，長期實踐及現代毒理學研究均表明，密蒙花具有極高的安全性，著色力強，染色效果好，色澤穩定，在食品工業具有極高的應用價值[18]。文獻[19]認為密蒙花含有多種氨基酸、微量元素、A-藏花素，4＇，5，7–三羥基黃酮，甘露糖醇及醉魚草甙等成分，對人體有營養和保健作用，色素提取物可不經純化而直接使用。本文研究也表明密蒙花黃色素粗提物中含有清除DPPH自由基的活性成分，如果對密蒙花黃色素進行純化，必然會造成這些活性成分的丟失，因此作者贊成文獻[19]觀點。

圖1及圖2關于光和溫度對密蒙花黃色素的研究結果與文獻[11-12]結果略有差異，主要由于研究中測定時間差異所造成，這也表明對于物質穩定性研究，應該盡量長時間進行監測，才能獲得更客觀的數據。

文獻[16-17]研究表明密蒙花成分具有抗菌作用，然而本文對密蒙花黃色素提取物對多種微生物的抗菌作用進行了檢測，均未見密蒙花黃色素提取物具有抗菌活性。文獻[17]研究表明，密蒙花的抗菌成分主要存在于石油醚、醋酸乙酯等有機相溶劑部分，而本文中提取的密蒙花黃色素為水溶性色素，難溶于丙酮和石油醚，這可能是本文研究結果與文獻[16-17]不同的主要原因之一，同時密蒙花提取物的濃度差異也會造成抗菌活性測定結果不同。從本文研究結果可見，即使密蒙花黃色素具有抗菌活性，其活性也十分微弱，在實際應用可以忽略。

[1]許龍,姚小磊,賀曉華,等.HPLC法測定密蒙花中3種黃酮類成分的含量[J].湖南中醫藥大學學報,2008,28(5):21-23

[2]張小曼,彭永芳,馬銀海.正交法微波輻射提取密蒙花黃色素[J].食品科學,2002,23(10):91-93

[3]師進霖.密蒙花的利用價值和栽培技術[J].中國林副特產,2004 (1):22-23

[4]韋獻飛,黃運坤.密蒙花黃色素的毒理學安全性評價[J].廣西預防醫學,1998,4(4):248

[5]王娟,張玟潔,曾雅雪,等.利用釀酒酵母轉座子文庫篩選MTM1基因缺失表型相關基因[J].微生物學報,2010,50(1):126-131

[6]沈萍,陳向東.微生物學實驗[M].4版.北京:高等教育出版社, 2007:241-242

[7]中華人民共和國衛生部,中國國家標準化管理委員會.GB/T 4789.7-2008食品衛生微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗[S].北京:中國標準出版社,2008:1-10[8]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.GB4926-2008食品添加劑紅曲米(粉)[S].北京:中國標準出版社,2008:1-5

[9]鄒磊,汪立君,程永強,等.加工工藝對豆豉抗氧化能力的影響[J].食品科學,2006,27(8):174-177

[10]孫力軍,陸兆新,陳磊,等.金銀花內生菌EJH-1抗菌作用發酵培養基響應面法優化[J].南京農業大學學報,2006,29(3):108-113

[11]殷彩霞,唐春,李聰,等.密蒙花黃色素性能研究[J].化學世界,2000 (1):33-37

[12]莫羨忠,陳文納,鄧肖云.天然食用密蒙花黃色素穩定性的研究[J].廣西化工,1996,25(3):9-12

[13]李教社,趙玉英,王邠,等.密蒙花黃酮類化合物的分離和鑒定[J].藥學學報,1996,31(11):849-854

[14]蔡凌云,韓素菊,肖杭,等.密蒙花總黃酮抗氧化活性[J].光譜實驗室,2011,28(3):1333-1346

[15]熊勇,熊揚波,楊青松.藥用植物密蒙花總黃酮提取及抗氧化性研究[J].生物技術,2011,21(3):85-87

[16]李秀蘭,孫光潔,戴樹培,等.密蒙花/結香有效成分的抑菌作用[J].西北藥學雜志,1996,11(4):165-166

[17]韓澎,崔亞君,郭洪祝,等.密蒙花化學成分及其活性研究[J].中草藥,2004,35(10):1086-1090

[18]武子龍,郭新婭.新型食用色素密蒙花黃天然色素研究概況[J].云南中醫中藥雜志,1995,16(2):34-35

[19]郭雷,朱文成,劉超.密蒙花化學成分及生物活性研究進展[J].食品研究與開發,2012,33(7):222-225

Studies on the Properties of Yellow Pigment from Buddleja officinalis Maxim

YANG Sheng-yuan，LI Zhuo-wen，LAI Yan-lian，FANG Xiao-xuan，CHEN Xiao-ping，YANG Na
（Department of Biology，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，Guangdong，China）

The properties of yellow pigment from Buddleja officinalis Maxim were investigated.The results indicated the yellow pigment from B.officinalis Maxim was easily dissolved in water and poorly soluble in petroleum ether，and the solubility of the yellow pigment in different solvents was water＞absolute ethyl alcohol＞acetone＞petroleum ether.The yellow pigment was stable at4，30℃and pH 4.92-9.18，but its stability was effect by high temperature，light and EDTA.The yellow pigment shows strong DPPH radical scavenging activity which was equal to10.01μg Trolox/mg，and shows no antimicrobial activities to Escherichia coli，Staphyloccocus aureus，Bacillus subtilis，Vibrio Parahemolyticus，Saccharomyces cerevisiae，Rhizopus stolonifer，Aspergillus niger and Penicillium citrinum at10 g/L.

Buddleja officinalis Maxim；yellow pigment；property

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.005

2013-07-24

國家星火計劃項目（2011GA780022）；潮州市科技引導計劃項目（2011N01）；韓山師范學院教授科研啟動項目（QD20110304）

楊勝遠（1972—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品微生物及功能性食品。