響應面法優化水溶性龍膽多糖的提取研究

王晨瑜，劉鑫，張晶，王戰勇

（遼寧石油化工大學化學化工與環境學部，遼寧撫順113001）

響應面法優化水溶性龍膽多糖的提取研究

王晨瑜，劉鑫，張晶，王戰勇*

（遼寧石油化工大學化學化工與環境學部，遼寧撫順113001）

采用響應面設計法（RSM）優化水溶性龍膽多糖的提取條件。在單因素試驗基礎上，結合響應面法優化確定提取水溶性龍膽多糖的最適工藝條件如下：提取溫度100℃，料液比1∶26.56（g/mL），提取時間3 h，提取次數2次。此條件下，水溶性龍膽多糖的提取率預測值為13.51％，水溶性龍膽多糖的試驗提取率為（13.36±0.25）％，預測值與驗證值吻合較好。

多糖；優化；響應面法；龍膽多糖；水溶性

龍膽為龍膽科植物龍膽（Gentiana scabra Bunge）的干燥根和根莖。主要藥效成分為龍膽苦苷、當歸苦苷、獐牙菜苦苷、龍膽多糖、龍膽堿等[1]。龍膽具有保肝、利膽、健胃、降壓、抗炎、增強免疫功能、抗甲亢，抗過敏及對中樞神經系統的影響等藥理作用[2]。龍膽多糖是龍膽的有效成分之一，具有重要的藥理活性。現代藥理學研究表明，龍膽多糖具有抗腫瘤[3]、降血脂[4]、抗凝血[5]、提高小鼠、雛雞[6]等的免疫功能等多種藥理作用。研究表明，龍膽中的多糖還有免疫調節、抗病毒、抗輻射、預防和治療糖尿病、抗氧化[7-8]等生理功能，可作為藥物用于臨床治療。

近些年，隨著人們生活水平的不斷提高，人們的健康保健意識在逐漸增強。多糖作為保健食品的主要成分己悄然興起。我國的多糖資源豐富，尤其是來源于中草藥的植物多糖，應用歷史悠久，具有巨大的開發前景[9]。對多糖的構效和量效關系的研究，可促進以多糖（或復方多糖）為主要成份的高附加值的保健食品生產開發。本研究研究了水溶性龍膽多糖的提取，為其進一步的深入開發提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

龍膽（Gentiana scabra Bunge），產地為撫順清原。苯酚購于北京鼎國生物技術有限責任公司；其余所有試劑均為國產分析純。

1.2 設備

LD5-2A低速離心機：北京醫用離心機廠；ALC-1100.2電子天平、ALC-210.4電子分析天平：德國賽多利斯股份公司；VIS-7220可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；A11basic分析研磨機：德國IKA公司。

1.3 方法

稱取1 000 g干燥的龍膽，粉碎后用80％乙醇（體積分數）80℃回流脫脂6 h，去除有色物質、單糖、低聚糖和小分子物質，4 000 r/min離心20min，回收沉淀，60℃真空干燥后待用。準確稱取龍膽樣品預處理樣品10 g，將樣品與水按設定條件進行浸提后，4 000 r/min離心20min，收集浸提液。加3倍體積無水乙醇醇沉過夜后，4 000 r/min離心15min，收集沉淀，沉淀使用無水乙醇洗滌3次，無水乙醚洗1次，充分干燥后即得到龍膽粗多糖。樣品可溶性總糖含量采用苯酚-硫酸法測定[10]。

1.4 響應面優化設計試驗

結合單因素試驗結果，采用中心復合設計三因素三水平的實驗，以提取時間、提取溫度、料液比為自變量，水溶性龍膽多糖產量為響應值，確定各因素水溶性龍膽多糖產量影響的顯著性，并利用響應面法對水溶性龍膽多糖的提取條件進行優化。

2 結果與討論

2.1 響應面分析試驗對水溶性龍膽多糖提取條件的優化

綜合單因素實驗，采用Box–Behnken實驗設計法，設計三因素三水平的響應面實驗，以提取溫度、提取時間、液料比、3個因素為自變量，以龍膽多糖提取率為響應值，所得到的數據列于表1。

表1 Box–Behnken設計方案（BBD）Table1 Experimental domain of Box–Behnken design（BBD）

根據對3個變量中心復合設計后所測得的水溶性龍膽多糖提取量結果如表2所示。

經過對實驗數據的多元回歸分析，響應變量和實驗變量的關系如下列二元多次方程：

表2 BBD實驗結果Table2 The results of response surface BBD

對方差進行分析，將擬合度和適合的模型總結于表3。

表3 方程擬合統計Table3 Fit statistics of Y

由表3可看出，決定系數（R2=0.980 4）表明了經過二次回歸模型方差分析，只有1.96％的總差異不能由模型來解釋。調整決定系數（調整R2=0.955 2）說明了該模型具有很高的顯著性。與此同時，一個很低的變化系數值4.907清楚的顯示出很高的精密度等級和實驗值很高的可靠性。此外，該模型的實驗值在預期的實驗變量的范圍內。進一步說明了回歸方程的擬合程度較好。

上述回歸得到的二元多次方程的回歸系數被列于表4。

P值是將觀察結果認為有效即具有總體代表性的犯錯概率，越小的P值匹配的系數就越可靠。表4可以看出一次系數（X2，X3），二次系數（X32）具有統計學意義，它具有較小的P值（P＜0.05）。可看出，提取時間、料液比對多糖提取率的影響最為顯著。

表4 預期二次多項式模型的變化系數Table4 Regression coefficients of the predicted quadratic polynomial model

根據回歸分析結果做出相應的響應等高面圖和曲面圖，以確認提取溫度（X1）、提取時間（X2）、料液比（X3）3因素對多糖提取率的影響，以此來推測出自變量和因變量的關系。結果見圖1，圖2和圖3。

圖1 溫度和時間對多糖產率影響的響應面等高線圖和3D圖Fig.1 Three-dimensional response surface graph and contour plots response surface graph of extraction temperature and time on the yield of polysaccharide

由圖1可看出，當其中當料液比一定時，提取時間保持不變，隨溫度的升高，龍膽多糖產率增加，且在高溫中要比在低溫中升高的速度快；溫度不變，隨提取時間的延長，龍膽多糖產率緩慢上升至穩定。由此可以推斷出，在料液比一定的條件下，高溫、延時有助于提高多糖產率。

圖2 時間和料液比及其相互作用對多糖產率影響的響應面等高線圖和3D圖Fig.2 Three-dimensional response surface graph and contour plots response surface graph of extraction time and solid-liquid ratio on the yield of polysaccharide

圖3 溫度和料液比及其相互作用對多糖產率影響的響應面等高線圖和3D圖Fig.3 Three-dimensional response surface graph and contour plots response surface graph of extraction temperature and the solid-liquid ratio on the yield of polysaccharide

由圖2可以看出，當提取溫度一定時，保持時間不變而增加料液比值，龍膽多糖的提取率緩慢上升直到穩定；保持料液比不變而延長浸提時間，龍膽多糖的提取率逐漸增加。由此表明，在提取溫度一定的情況下，提高料液比和延長提取時間有利于提高多糖的提取率。

由圖3可以看出，在提取時間不變的條件下，龍膽多糖產率隨溫度和料液比的增加而增加。

根據所得回歸模型，可預測最佳工藝為提取溫度為100℃、提取時間為3 h、料液比為1∶26.56（g/mL），此時多糖提取率理論上可達13.51％。為了檢驗試驗結果是否與真實情況一致，根據以上試驗結果進行了近似驗證試驗，進行3次平行試驗，以驗證實驗檢測值與理論預測值是否相符，進行可靠分析，得到最后優化方案。結果水溶性龍膽多糖實際提取率為（13.36± 0.25）％，理論預測值相比理論值誤差較小，可見該模型能較好地模擬和預測試驗產率。

3 結論

本研究采用響應面法優化龍膽多糖提取工藝參數，得出最佳提取條件為：提取次數為2次，提取溫度為100℃，提取時間為3 h，料液比為1∶26.56（g/mL）。此條件下，水溶性龍膽多糖的提取率預測值為13.51％，水溶性龍膽多糖的實驗提取率為（13.36±0.25）％，在這個條件下與預期值十分接近，說明模型比較可靠。為下一步的大規模提取龍膽多提供了參考。

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[4]江蔚新,何文順,趙璽.龍膽多糖的降血脂作用的研究[J].黑龍江醫藥,2008,21(4):31-33

[5]江蔚新,趙璽.龍膽多糖的抗凝血作用的研究[J].黑龍江醫藥,2008, 21(5):31-32

[6]孟博,王臣,趙蔓,等.龍膽多糖對雛雞免疫功能的影響[J].中國農村小康科技,2010(4):57-58

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[10]張惟杰.糖復合物生化研究技術[M].杭州:浙江大學出版社,2003: 11-12

Optimization of Extraction of Water-solubility Polysaccharide from Gentiana scabra Bunge by Response Surface Methodology

WANG Chen-yu，LIU Xin，ZHANG Jing，WANG Zhan-yong*
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Environmental Engineering，Liaoning Shihua University，Fushun 113001，Liaoning，China）

Response surface methodology（RSM）was used to optimize the extraction conditions of watersolubility polysaccharides from the Gentiana scabra Bunge（GSP）.Combining single factor test and response surface methodology，the optimum extraction conditions were chosen as follows：extraction temperature was 100℃，ratio of water to raw material was 26.56，extraction time was 3 h，and number of extraction was 2.Under the optimize conditions，the predicted value of yield of GSP was 13.51％，and the experimental yield of GSP was（13.36± 0.25）％，which showed the results were reasonable.

polysaccharides；optimization；response surface methodology；Gentiana scabra Bunge；watersolubility

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.009

2012-12-03

王晨瑜（1986—），女（漢），在讀碩士，研究方向：生物化工。

*通信作者