固體試劑比色法測(cè)定食品中過氧化氫的研究

金露，汪倩，虞選柯，郭應(yīng)建，時(shí)新超，趙澎濤，黃光榮，*

（1.中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310018；2.杭州天邁生物科技有限公司，浙江杭州310018）

固體試劑比色法測(cè)定食品中過氧化氫的研究

金露1，汪倩1，虞選柯1，郭應(yīng)建1，時(shí)新超1，趙澎濤2，黃光榮1，*

（1.中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310018；2.杭州天邁生物科技有限公司，浙江杭州310018）

建立一種通過易于保存的固體試劑來快速測(cè)定食品中過氧化氫的分光光度法。以固體酸氨基磺酸代替硫酸提供酸性環(huán)境，以草酸鈦鉀代替二氧化鈦提供鈦離子，酸性條件下鈦離子與過氧化氫反應(yīng)形成穩(wěn)定的橙色絡(luò)合物，通過分光光度計(jì)比色測(cè)定過氧化氫的含量。優(yōu)化后的測(cè)定條件為：波長(zhǎng)為390 nm，氨基磺酸和草酸鈦鉀的用量分別為100mg和180mg，反應(yīng)溫度為25℃，反應(yīng)時(shí)間10min。該方法在過氧化氫含量為1.0mg/L～5.0mg/L時(shí)與吸光度呈線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，最低檢出限為0.45mg/L，測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3％，平均加標(biāo)回收率為91.6％～106％。

固體試劑；快速測(cè)定；過氧化氫；分光光度法

過氧化氫（H2O2）溶液，俗稱雙氧水，為無色無味的液體，是一種強(qiáng)氧化劑，具有較好的殺菌和漂白作用，因此有著廣泛的用途：如在醫(yī)院用作殺菌消毒劑清洗傷口，工業(yè)中雙氧水廣泛用于造紙業(yè)、紡織業(yè)等。在食品行業(yè)中，過氧化氫曾主要用于食品包裝、食品纖維等方面的消毒殺菌和作為加工助劑，在使用過程中會(huì)產(chǎn)生大量活潑的羥基自由基，具有極強(qiáng)的氧化性[1]。但是，研究表明，吸入過量H2O2可使人中毒，一定量的H2O2對(duì)人體黏膜具有強(qiáng)烈的刺激作用[2]；低濃度H2O2會(huì)抑制線粒體的功能，使其數(shù)量減少，活力降低，抗氧化能力減低，能量合成障礙；高濃度H2O2會(huì)使血小板凋亡，抗氧化能力升高[3]；H2O2造成H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷和DNA損傷，隨著其暴露劑量和時(shí)間的不同表現(xiàn)為凋亡和壞死[4]。因此，我國(guó)衛(wèi)生部在2011年出臺(tái)的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760-2011）已經(jīng)將H2O2排除在食品添加劑之外[5]，只能作為食品用消毒劑及其原料繼續(xù)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)和使用。但是，H2O2在食品中的濫用情況還時(shí)有發(fā)生，部分食品加工廠為了食品增白，往往采用工業(yè)雙氧水來處理食品，以提高產(chǎn)品的外觀，達(dá)到以次充好的目的。因此，建立簡(jiǎn)便快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)雙氧水濫用現(xiàn)象的監(jiān)管將具有重要意義。

目前，對(duì)過氧化氫的檢測(cè)主要有碘量法、鈦鹽比色法、辣根過氧化物酶-DPD法和色譜法等[1，6-7]。碘量法操作繁瑣，檢測(cè)限較高，不適合快速檢測(cè)。DPD法方法對(duì)低濃度過氧化氫的測(cè)定較準(zhǔn)確，但辣根過氧化物酶價(jià)格較貴且不易保存、容易失活。色譜法操作較為繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，也不適合于快速檢測(cè)。鈦鹽比色法是基于過氧化氫在酸性溶液中，與鈦離子生成穩(wěn)定的橙色絡(luò)合物—過鈦酸，其吸光度與樣品中過氧化氫含量在一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系的原理[8]，簡(jiǎn)單易行，但是《食品中殘留過氧化氫的測(cè)定方法》（GB/T23499-2009）中的鈦鹽比色法耗時(shí)較長(zhǎng)、需要使用濃硫酸，因此也不適合于快速檢測(cè)。因此，為了檢測(cè)方便、實(shí)用、延長(zhǎng)試劑的使用期，以適合于快速檢測(cè)，本文對(duì)國(guó)標(biāo)方法中的鈦鹽比色法進(jìn)行改進(jìn)，用固體酸氨基磺酸來提供酸性環(huán)境、用草酸鈦鉀代替二氧化鈦，通過對(duì)最佳波長(zhǎng)、試劑用量、反應(yīng)溫度及時(shí)間等的進(jìn)一步探究，確定了分光光度法快速檢測(cè)的最佳反應(yīng)條件，并應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

UV1000型紫外可見分光光度計(jì)、CT14RD型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海天美科技有限公司；JA2003型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；KQ-2200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；超級(jí)恒溫水浴槽（HH-4數(shù)控恒溫水浴鍋）：國(guó)華電器有限公司。

1.1.2 試劑

使用分析純及以上級(jí)別的化學(xué)試劑和蒸餾水；過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：移取30％過氧化氫3.0mL，以去離子水定容至100mL，混勻，并按國(guó)標(biāo)GB/T 23499-2009中的高錳酸鉀滴定法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行滴定，求得濃度；再移取適量過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以蒸餾水稀釋定容成5.0mg/L標(biāo)準(zhǔn)使用液，標(biāo)準(zhǔn)使用液當(dāng)天配置。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法

準(zhǔn)確吸取50mL待測(cè)溶液，在水浴中恒溫5min，加入一定量的固體氨基磺酸和草酸鈦鉀，溶解，恒溫一定時(shí)間，以蒸餾水的試劑溶液為空白對(duì)照，用1 cm比色皿，于一定波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光度。

1.2.2 樣品預(yù)處理

選取市售的魷魚絲、豬發(fā)皮、銀耳三種樣品作為分析檢測(cè)的對(duì)象。樣品經(jīng)過簡(jiǎn)單的剪碎處理后，稱取2.00 g于燒杯中，加入約60mL去離子水溶解，超聲波提取10min，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，加入20％三氯乙酸25mL定容至刻度（三氯乙酸濃度為5％），靜置片刻后，取上清液在8 000 r/min的條件下離心10min，再將上清液經(jīng)抽濾后得到待測(cè)樣液；以蒸餾水代替樣品，提取步驟同樣品處理，最后的上清液作為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定過程的參數(shù)優(yōu)化

2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

吸取5mg/L過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50mL與去離子水50mL于兩小燒杯中，經(jīng)顯色反應(yīng)后在380 nm～ 450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)每隔5 nm波長(zhǎng)測(cè)定一次吸光度，結(jié)果在390 nm處有最大吸收值（如圖1所示），與文獻(xiàn)報(bào)道過氧化氫與鈦離子形成的復(fù)合物檢測(cè)波長(zhǎng)430 nm或410 nm[7，9]接近，選擇測(cè)定波長(zhǎng)為390 nm。

圖1 鈦離子-過氧化氫復(fù)合物在360 nm～430 nm范圍的光譜圖Fig.1 The spectrum of titanium-hydrogen peroxide complex at 360 nm-430 nm

2.1.2 氨基磺酸用量的確定

顯色反應(yīng)的酸度條件直接影響顯色反應(yīng)程度。在反應(yīng)體系中加入氨基磺酸分別為50、100、150、200、250、300mg條件下，按1.2.1的實(shí)驗(yàn)方法，在390 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果如圖2所示。

該結(jié)果表明，在體系中加入100mg時(shí)，體系的吸光度最大，故采用100mg的氨基磺酸。

2.1.3 草酸鈦鉀用量的確定

圖2 氨基磺酸加入量對(duì)吸光值的影響Fig.2 Effect of amino sulfur acid on absorbance

顯色劑草酸鈦鉀的用量對(duì)測(cè)定體系吸光度的影響顯著。在體系中分別加入草酸鈦鉀80mg～200mg，氨基磺酸加入量為2.1.2中確定的100mg，按1.2中實(shí)驗(yàn)方法在390 nm處測(cè)定溶液的吸光度結(jié)果，見圖3。

圖3 草酸鈦鉀的用量對(duì)吸光度的影響Fig.3 Effect of titanium potassium oxalate on absorbance

由圖3可知，當(dāng)草酸鈦鉀的用量在180mg時(shí)，測(cè)定體系的吸光度達(dá)到最大值，所以采用180mg草酸鈦鉀。

2.1.4 反應(yīng)溫度與時(shí)間的確定

不同的溫度、不同時(shí)間下體系反應(yīng)進(jìn)行的程度可能是不同的。按照1.2.1實(shí)驗(yàn)方法，在以上得到的最適條件下，將恒溫水浴溫度分別設(shè)置成25、30、40℃，進(jìn)行多組實(shí)驗(yàn)。并分別在10、15、20、25、30min時(shí)測(cè)定每組的吸光度，測(cè)定結(jié)果見圖4。

圖4反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.4 Effect of reaction temperature and time on absorbance

圖4 表明，30min內(nèi)同一水浴中的體系光度值變化很小，以及同一溫度下，不同水浴的反應(yīng)體系吸光值也很相近，由此可見，反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)體系的影響很小，故選擇溫度為25℃（室溫）、反應(yīng)時(shí)間為10min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

分別配制1、2、3、4、5mg/L的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.1實(shí)驗(yàn)方法，并在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，在390 nm下測(cè)定吸光值。結(jié)果表明，在1mg/L～5mg/L過氧化氫范圍內(nèi)，吸光值與過氧化氫溶液具有較好的線性關(guān)系（見圖5），回歸方程為y=0.029 2x-0.005，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。

圖5 固體試劑分光光度法測(cè)定過氧化氫的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.5 The standard curve of hydrogen peroxide determination by solid reagents spectrometric method

2.3 方法檢出限

國(guó)際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）對(duì)分析方法的檢出限D(zhuǎn)L作如下規(guī)定[7]：

式中：K為根據(jù)一定置信水平確定的系數(shù)；Sb為空白多次測(cè)得信息的標(biāo)準(zhǔn)偏差；α為方法的靈敏度（即校準(zhǔn)曲線的斜率）。

1975年，IUPAC建議對(duì)光譜化學(xué)分析法取K=3。由于低濃度水平的測(cè)量誤差可能不遵從正態(tài)分布，且空白的測(cè)定次數(shù)有限，因而與K=3相應(yīng)的置信水平大約為90％。

根據(jù)以上規(guī)定，本試驗(yàn)方法測(cè)定空白吸光度標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.34×10-3（n=12），計(jì)算出的最低檢出限D(zhuǎn)L= 0.45mg/L。由此可見，該法測(cè)定過氧化氫具有較高的靈敏度，且檢出限較低。

2.4 方法精密度測(cè)定

配制了質(zhì)量濃度分別為5mg/L過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測(cè)定8次，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 測(cè)定方法的精密度Table1 The precision of the provided test method

由表1可見，濃度為5mg/L的過氧化氫RSD為2.14％，小于5％，達(dá)到了分析的要求，且重現(xiàn)性好。

2.5 樣品測(cè)定及回收率試驗(yàn)

移取一定量待測(cè)樣液按試驗(yàn)方法1.2.1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以試劑空白作對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)3次，并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。得到結(jié)果，如表2所示。

表2 測(cè)定方法的加標(biāo)回收率Table2 The recovery rate of the provide test method

從表2可見，本快速測(cè)定方法應(yīng)用于3種實(shí)際樣品中的過氧化氫測(cè)定的回收率為91.6％～106％，所以該方法適用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本文利用固體試劑代替國(guó)標(biāo)食品中過氧化氫分光光度法測(cè)定中的硫酸與二氧化鈦，測(cè)定食品中過氧化氫的含量。通過試驗(yàn)探究了測(cè)定的最佳條件，結(jié)果表明：反應(yīng)體系的最大吸收波長(zhǎng)為390nm，在50mL反應(yīng)體系中加入100mg氨基磺酸提供酸性環(huán)境，180mg草酸鈦鉀作為顯色劑，于25℃條件下反應(yīng)10min后測(cè)定吸光值，可以準(zhǔn)確地測(cè)定過氧化氫的含量。本方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，快速且簡(jiǎn)易，而且用固體試劑代替溶液具有保存方便、使用簡(jiǎn)單、便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)，可作為食品中過氧化氫快速測(cè)定的方法。

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Determination of Hydrogen Peroxide in Food by Spectrophotometric Method with Solid Reagents

JIN Lu1，WANG Qian1，YU Xuan-ke1，GUO Ying-jian1，SHI Xin-chao1，ZHAO Peng-tao2，HUANG Guang-rong1，*
（1.College of Life Sciences，China Jiliang University，Hangzhou 310018，Zhejiang，China；2.Hangzhou Tianmai Biological Technology Co.，Ltd.，Hangzhou 310018，Zhejiang，China）

A kind of fast determination method of hydrogen peroxide in food by spectrophotometric with solid reagents was established in this paper.In this method，solid acid（amino sulfonic acid）was used to substitute for sulphuric acid to provide acid reaction condition and titanium potassium oxalate was used to substitute for titanium dioxide to provide titanium ion.The titanium ion was reacted with hydrogen peroxide under acid condition to form an orange complex and the color was determined by spectrophometric method to estimate hydrogen peroxide content.The optimum test conditions for hydrogen peroxide were determination wavelength of 390 nm，solid acid addition quantity of 100mg，titanium potassium oxalate addition quantity of 180mg，reaction temperature of 25℃and reaction time of10min.In this method，the hydrogen peroxide content within 1.0 to 5.0mg/L had linear relationship with absorbance，and the correlation coefficient of the standard curve（R2）was 0.999 4.The minimum detection limit of the provided method was 0.45mg/L，RSD was below 3％，and the average recovery rate of the sample was under 91.6％to106％.

solid reagents；fast determination；hydrogen peroxide；spectrophotometric method

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.020

2012-10-22

浙江省新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目（2012R409026）；杭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（20110533B31）

金露（1991—），男（漢），本科，研究方向：食品安全快速檢測(cè)。

*通信作者