表面活性劑輔助萃取雪靈芝黃酮及結構初析

霍彤，孫寶國，王昌濤，*，孫嘯濤，周雪

（1.北京工商大學北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京100048；2.北京工商大學食品學院，北京100048）

表面活性劑輔助萃取雪靈芝黃酮及結構初析

霍彤1，孫寶國2，*，王昌濤1，*，孫嘯濤2，周雪1

（1.北京工商大學北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京100048；2.北京工商大學食品學院，北京100048）

利用正交試驗法對雪靈芝中黃酮類質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化，應用高效液相色譜法對提取樣品的成分進行了初步分析。通過單因素試驗分別考察表面活性劑種類、表面活性劑用量、乙醇體積分數(shù)、料液比、回流溫度、回流時間對雪靈芝黃酮提取率的影響，選取適當?shù)脑囼炓蛩嘏c水平，利用正交法設計試驗，對各個因素的顯著性和交互作用進行分析。結果表明：乙醇體積分數(shù)為5%，十二烷基苯磺酸鈉濃度0.25%，料液比為1∶30（g/mL），提取時間30min，提取溫度70℃，此條件下黃酮提取率可達1.75%，樣品經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)含有少量槲皮素和山奈酚，表面活性劑輔助浸提法在植物資源提取領域顯示出了優(yōu)良的應用前景。

雪靈芝；提取；十二烷基苯磺酸鈉；正交試驗；高效液相色譜

雪靈芝（Arenaria kansuensis Maxim.）又名草靈芝，屬石竹科（Caryophyllaceae）蚤綴屬（Arenaria）植物，分布于海拔5 000m左右的甘肅、青海、四川西部及西藏地區(qū)[1-2]，是生長海拔最高的綠色開花植物之一。研究發(fā)現(xiàn)雪靈芝含有黃酮類化合物，具有免疫調(diào)節(jié)[3-4]、抗腫瘤[5]、抗自由基活性[6]等多種功效。黃酮類化合物是指以2-苯基苯并吡喃酮為母核，即以C6-C3-C6為骨架結構的一大類天然化合物及其衍生物[7-8]，極性相對較小，一般為植物體多酚類代謝物。對植物體內(nèi)黃酮類物質(zhì)提取研究的報道很多，常用的提取方法包括：加熱水浴回流法[9]、超聲提取法[10]、微波提取法[11]、索式提取法[12]、閃式提取法[13]和超臨界流體萃取法[14]等。但上述提取法一方面提取率較低；另一方面，在提取過程中均需使用濃度較高的有機試劑，對環(huán)境污染較大。表面活性劑能夠顯著降低表面張力，提高弱極性物質(zhì)的溶解性，已有文獻報道將其應用于植物資源提取領域[15-17]。

目前，對雪靈芝黃酮提取的深入研究報道還較少，本研究在已有工作基礎上，通過正交試驗設計[18]，應用表面活性劑輔助浸提法對雪靈芝黃酮的提取工藝進行了系統(tǒng)研究，以達到保障提取率和減少有機溶劑消耗的目的，屬于綠色化學范疇；高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）具有高速、高效、高靈敏度的特點，本研究應用HPLC對提取物的結構進行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪靈芝：市購，產(chǎn)地西藏喜馬拉雅山脈，特級品。

乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等（均為分析純）北京化學試劑廠；蘆丁對照品（純度≥98%，生產(chǎn)批號100080-200707）中國藥品生物制品檢定所；十二烷基苯磺酸鈉（LAS）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十二烷基三甲基氯化銨（DTAC）、十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB）、聚氧乙烯月桂醚（Brij-35）、吐溫20（Tween 20）、曲拉通X-100（X-100）、雙（2-乙己基）磺基丁二酸鈉（Aerosol OT）蘆丁標準品、槲皮素標準品、山奈酚標準品：上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-T6型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；RE-52CS/5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SHB-B95循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TB-2002電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；ZN-04B小型粉碎機：北京興時利和科技發(fā)展有限公司；1525高效液相色譜儀（配2707自動進樣器、2489紫外檢測器）：美國Waters科技有限公司。

1.3 雪靈芝黃酮的提取方法

取干燥雪靈芝，粉碎過60目篩，準確稱量2.00 g，按一定比例加入表面活性劑，按一定料液比加入不同體積分數(shù)乙醇溶液，在一定溫度下回流提取，待提取液冷卻至室溫后減壓抽濾，按1∶1比例加入無水乙醇（因為提取液有機溶劑濃度較低，提取工程可將蛋白質(zhì)和多糖一并萃取，因此加入無水乙醇將雜質(zhì)沉淀），混勻后靜置60min，15 000 r/min離心10min，取上清液用體積分數(shù)為70%的乙醇定容為25mL，混勻后測定總黃酮含量。

1.4 總黃酮含量的測定方法

雪靈芝總黃酮含量測定應用鋁絡合物顯色法。

1.4.1 蘆丁標準曲線的繪制

蘆丁標準曲線的配置采取本課題組之前建立的方法。具體過程為：精確稱取120℃干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標準品50.3mg，無水乙醇定容至50mL，超聲，得到質(zhì)量濃度為1mg/mL的標準液。

準確移取上述標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于25mL容量瓶中，各加入5 g/100mLNaNO2溶液0.8mL，搖勻，靜置6min；加入10 g/100mL Al（NO3）3溶液0.8mL，搖勻，靜置6min；加入1mol/LNaOH溶液10.00mL，用體積分數(shù)為70%乙醇溶液定容至25.00mL，搖勻，靜置10min～15min，于510 nm波長處測定吸光度。以標準溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，y=1.724 9x+0.010 5，R2=0.999 7。

1.4.2 雪靈芝中總黃酮含量的測定

精確移取樣品溶液1.00mL于25mL容量瓶中，按照1.4.1節(jié)方法測定吸光度。

1.4.3 黃酮提取率的計算公式

式中：Y1為總黃酮提取率，（mg/g）；C1為吸光度按照標準曲線計算出得顯色溶液中得質(zhì)量濃度，（mg/ mL）；V1為顯色時溶液的定容體積，mL；V2為顯色時移取的提取液的體積，mL；V為提取液的總體積，mL；m為稱取樣品的質(zhì)量，g。

1.5 單因素試驗

依1.3實驗方法分別考察表面活性劑種類、表面活性劑用量、乙醇體積分數(shù)、料液比、回流溫度、回流時間對雪靈芝總黃酮提取率的影響。

1.6 正交試驗設計

依據(jù)單因素試驗結果，以影響雪靈芝黃酮提取率的主要因素作為考察因素，采用正交試驗模型優(yōu)化和預測雪靈芝黃酮化合物的提取工藝。

1.7 高效液相色譜法對雪靈芝黃酮純度的測定

色譜檢測條件：Waters Ultimate XB-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為乙腈-水（含0.05%乙酸），流速1mL/min，進樣體積15μL，等度洗脫：乙腈：水（含0.05%乙酸）=55∶45。運行時間：45min；柱溫：30℃；檢測波長：375 nm。

精確稱取槲皮素、蘆丁和山奈酚標準品10mg于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1mg/mL的三種黃酮標準品溶液。各吸取0.5mL混勻置于樣品瓶中，再加入0.5mL甲醇，混勻，即得到0.5mg/mL黃酮混合標準品溶液，進樣分析。

實際提取樣品過0.45μm濾膜后直接進樣分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取率的影響

由于黃酮極性較弱，水溶液中溶解性較差，因此，升高乙醇濃度勢必會提高黃酮得率，但本研究引入表面活性劑的初衷即為減少有機溶劑的消耗量，并非單純?yōu)榱颂崛÷剩狙芯繉⒁掖紳舛冗x定為5%。

2.1.2 表面活性劑種類對黃酮提取率的影響

表面活性劑的種類對提取效果的影響差異較大，分別選擇了毒性較低的：十二烷基苯磺酸鈉（LAS）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十二烷基三甲基氯化銨（DTAC）、十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB）、聚氧乙烯月桂醚（Brij-35）、吐溫20（Tween 20）、曲拉通X-100（X-100）、雙（2-乙己基）磺基丁二酸鈉（Aerosol OT）等八種表面活性劑，考察了在純水和5%乙醇兩種提取介質(zhì)中對雪靈芝黃酮提取率的影響。表面活性劑種類對黃酮提取率的影響見圖1。

圖1表面活性劑種類對雪靈芝黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of types of surfactant on the extraction of flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim

圖1 結果顯示單純使用表面活性劑輔助純水浸提提取率均小于0.5%，提取效率很低；當使用5%乙醇作為提取液時LAS顯示出較高的提取率接近1.6%遠高于其它7種表面活性劑，因此，本研究選用LAS作為潛在高效表面活性劑進行系統(tǒng)研究。

2.1.3 不同表面活性劑濃度提取率的影響

選取十二烷基苯磺酸鈉的添加量在0.06%～0.25%的范圍作為考察對象，不同表面活性劑濃度對雪靈芝黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 表面活性劑的濃度對雪靈芝黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of concentration of surfactant on the extraction of flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim

如圖2所示，雪靈芝黃酮提取率隨著十二烷基苯磺酸鈉的添加量在0.06%～0.25%范圍內(nèi)增加而升高，當十二烷基苯磺酸鈉濃度為0.25%時提取率最高，原因是黃酮類化合物極性較小，因此，隨著十二烷基苯磺酸鈉的添加量增加溶解度增大，提取率升高；當十二烷基苯磺酸鈉添加量繼續(xù)增加時提取率驟然增大，原因可能是高十二烷基苯磺酸鈉添加量使得一些蛋白質(zhì)溶出量增加，參與顯色反應使干擾因素增大進而影響最終的測定，導致黃酮類化合物的驟然增大。

2.1.4 料液比對黃酮提取率的影響

考察不同料液比（g/mL），即1∶20、1∶30、1∶40和1∶50對雪靈芝黃酮提取率的影響，結果見圖3。

圖3 料液比對雪靈芝黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on the extraction of flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim

如圖3所示，隨著料液比的增大黃酮提取率隨之升高，當料液比達到1∶40后，繼續(xù)增大料液比提取率反而下降，原因可能是高乙醇體積使得一些醇溶性雜質(zhì)溶出量增加從而與黃酮類化合物競爭，并參與顯色反應使干擾因素增大進而影響最終的測定，導致黃酮類化合物的提取率下降。從減少試劑用量和保證提取效率的綜合考慮，最優(yōu)的料液比為1∶40（g/mL）。

2.1.5 提取溫度對黃酮提取率的影響

考察不同溫度對雪靈芝黃酮提取率的影響，結果見圖4。

圖4 提取溫度對雪靈芝黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction yield of flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim

在固定乙醇體積分數(shù)為5%、LAS添加量為0.12%、料液比為1∶40、提取時間為1 h的條件下，不同提取溫度對雪靈芝黃酮提取率的影響如圖4所示，在40℃～90℃的溫度范圍內(nèi)，提取率隨提取溫度的升高而增大，原因可能是溫度的增加能夠降低提取溶劑的黏度，促進介質(zhì)傳遞同時增加溶解度；當溫度高于70℃后進一步升高溫度，提取率略微降低。從整體趨勢走向可以看出，提取率的變化范圍比較小，從降低提取成本和保證提取率的綜合因素考慮，最優(yōu)提取溫度為70℃。2.1.6提取時間對黃酮提取率的影響

考察不同的提取時間對雪靈芝黃酮提取率的影響，結果見圖5。

圖5 提取時間對雪靈芝黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction yield of flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim

在固定乙醇體積分數(shù)為5%、AR添加量為0.12%、料液比為1∶30、提取溫度為70℃的條件下，不同提取時間對雪靈芝黃酮提取率的影響如圖5所示，隨著提取時間的延長，總黃酮提取率在1.06%～1.10%范圍內(nèi)波動，波動范圍較小，因此確定該單因素為不影響因素。從減少提取時間和保證提取率的綜合因素考慮，最優(yōu)提取時間為0.5 h。

2.2 正交試驗優(yōu)化雪靈芝黃酮提取工藝及確認

2.2.1 正交試驗優(yōu)化雪靈芝黃酮提取工藝

根據(jù)單因素試驗的結果，選擇表面活性劑濃度、料液比、提取溫度三個單因素設計三因素兩水平的正交試驗，主體間因子設計見表1。

按照主體間因子設計表設計正交試驗，試驗結果分析見表2、表3。

表1 主體間因子表Table1 Between-subjects factors table

表2 主體間效應的檢驗表Table2 Between-subjects effects test table

表3 估算邊界均值檢驗表Table3 Estimating border means test table

由表2分析可知，各因素水平對結果影響的強弱順序是：表活濃度＞提取溫度＞料液比，其中表活濃度對提取率影響最大，提取溫度和料液比對提取率影響非常小，但是三種單因素對提取率的影響均為不顯著；由表3分析可知，各因素水平對提取率的影響結果為：A2＞A1，B1=B2，C1＞C2。因此最佳工藝選取5%乙醇作為提取劑，表活濃度0.25%，料液比為1∶30，提取時間30min，提取溫度70℃。

2.2.2 雪靈芝黃酮最佳提取工藝的確證

在選取的各因素范圍內(nèi)，根據(jù)正交實驗得出雪靈芝黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)為5%，LAS濃度0.25%，料液比為1∶30，提取時間30min，提取溫度70℃。在此條件下進行實驗驗證，平行測定6批樣品，提取率分別為1.747%，1.743%，1.734%，1.757%，1.762%，1.749%，波動范圍很小，故本最佳工藝條件合理，同時也表明此工藝具有較好的穩(wěn)定性。

2.3 HPLC法對提取物的結構分析

圖6所示為標準品蘆丁，槲皮素和山奈酚的色譜圖，對應的保留時間分別為15.4min，33.4min和34.9min。通過HPLC法對標準品分析的色譜圖結果見圖6。

圖6 標準品的HPLC色譜圖Fig.6 The chromatogram of standards

HPLC法對雪靈芝提取物的分析結果見圖7。

圖7 實際樣品的HPLC色譜圖Fig.7 The chromatogram of real sample

將實際經(jīng)提取獲得的黃酮類物質(zhì)依1.7方法直接進HPLC分析，結果如圖7所示，編號為1、2色譜峰的保留時間分別為33.6和34.8min，與標準品槲皮素和山奈酚的色譜峰相對應，即提取得到的黃酮類物質(zhì)中含有槲皮素和山奈酚，同時由吸光度數(shù)據(jù)可以看到含量較低。

3 結論

本研究首先通過單因素試驗分別考察表面活性劑種類、表面活性劑用量、乙醇體積分數(shù)、料液比、回流溫度、回流時間對雪靈芝總黃酮提取率的影響，確定了影響黃酮提取率的主要因素，在此基礎上，利用正交實驗得到了最優(yōu)提取工藝條件，并進實驗行驗證，雪靈芝黃酮的最佳提取工藝條件：乙醇體積分數(shù)為5%，LAS濃度0.25%，料液比為1∶30，提取時間30min，提取溫度70℃，此條件下黃酮提取率可達1.75%，樣品經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)含有少量槲皮素和山奈酚，表面活性劑輔助浸提法在植物資源提取領域顯示出了優(yōu)良的應用前景。

[1]黃勇,許倩兮,彭光華.藏藥雪靈芝中總皂苷含量的測定[J].中國藥師,2010,13(1):94-96

[2]唐昌林.中國植物志第26卷[M].北京:科學出版社,2004:187-188

[3]彭寶珠,馮偉力,王利彥,等.藏藥雪靈芝對炎癥和免疫功能的影響[J].中國中藥雜志,1991,16(6):363-366

[4]李鳳文,趙鵬,劉榮珍,等.雪靈芝調(diào)節(jié)小鼠免疫功能作用的實驗研究[J].中國熱帶醫(yī)學,2007,7(11):1999-2000

[5]趙鵬,姚思宇,王彥武,等.雪靈芝對二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌組織細胞的抑制作用[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007, 11(38):7553-7555

[6]付翔,陳薇,段小群,等.雪靈芝提取物清除羥基自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2010,17(7):35-36

[7]Liu W,Kong Y,Zu Y,et al.Determination and quantification of active phenolic compounds in pigeon pea leaves and its medicinal product using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2010,1217(28):4723-4731

[8]Inbaraj BS,Lu H,Kao TH,et al.Simultaneous determination of phenolic acids and flavonoids in Lycium barbarum Linnaeus by HPLCDAD-ESI-MS[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2010,51(3):549-556

[9]Tang H,Chang L,Ding C,et al.Process research on the reflux extraction of flavonoids from Rubus crataegifolius leaves[J].Medicinal Plant,2012,3(6):58-60,63

[10]Pan G,Yu G,Zhu C,et al.Optimization of ultrasound-assisted extraction(UAE)of flavonoids compounds(FC)from hawthorn seed(HS) [J].Ultrasonics Sonochemistry,2012,19(3):486-490

[11]Yi J,Wu J,Wu Y,et al.Ultrasound and microwave assisted extraction of luteolin from Eclipta prostrate[J].African Journal of Pharmacy and Pharmacology,2013,7(4):114-124

[12]李維莉,馬銀海,彭永芳,等,云南栘依總黃酮提取工藝研究[J].食品科學,2006,27(7):147-149

[13]韓帥，李淑燕，陳芹芹,等,響應面分析法優(yōu)化閃式提取胡柚皮中黃酮類化合物工藝[J].食品科學,2011,32(10):52-56

[14]He J,Shao P,Liu J,et al.Supercritical carbon dioxide extraction of flavonoids from pomelo(Citrus grandis(L.)Osbeck)peel and their antioxidant activity[J].International Journal of Molecular Sciences, 2012,13:13065-13078

[15]馬祥，晏日安.超聲波-表面活性劑協(xié)同提取竹葉總黃酮的工藝[J].食品科學,2012,33(22):76-80

[16]趙二勞,郭青枝,郭春燕,等.表面活性劑CTMAB-微波協(xié)同提取山楂黃酮的研究[J].中國食品添加劑,2010(6):88-91

[17]顏賢仔,王純榮,寇磊.表面活性劑-超聲法提取野生刺五加黃酮工藝[J].食品工業(yè)科技,2011(12):314-317

[18]張吉祥,趙文靜,白曉杰,等.正交試驗法優(yōu)化黑米黑色素的超聲輔助提取工藝[J].食品科學,2010,31(4):39-41

Study on Surfactant-assisted Extraction Process and Preliminary Structural Analysis of Total Flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim

HUO Tong1，SUN Bao-guo2，*，WANG Chang-tao1，*，SUN Xiao-tao2，ZHOU Xue1
（1.Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development，Beijing Technology&Business University，Beijing 100048，China；2.School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology& Business University，Beijing 100048，China）

The optimum conditions for the extraction of flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim were determined using orthogonal experiment.An analysis method with high performance liquid chromatography（HPLC）was established to study the composition of extraction.On the basis of single-factor experiments，the effect on extraction yield was investigated by surfactant kind，surfactant amount，ethanol concentration，extraction duration，extraction temperature and liquid-to-solid ratio.Based on this，the significance of the various factors and interactions were analyzed with the use of orthogonal experiment.The optimal extraction conditions for flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim were ethanol concentration of 5%，sodium dodecylbenzene sulfonate（LAS）concentration of0.25%，liquid-to-solid ratio of1∶30（g/mL），extraction temperature of 70℃ and extraction time of 0.5 h.Under the optimized conditions，the maximum extraction yield of flavonoids was 1.75%.The extraction had a small amount of quercetin and kaempferol which was analyzed by HPLC.Therefore，the extraction method that surfactant-assisted showed good application prospects in the field of extraction effective components of plant.

Arenaria kansuensis Maxim.；extraction；dodecylbenzene sulfonate；orthogonal experiment；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.005

2014-03-19

北京市科技新星項目（2008B08）；“中青年骨干人才培養(yǎng)計劃”項目（PHR20110873）；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項（201010023）

霍彤（1987—），女（漢），研究生，碩士，研究方向：化妝品生物技術。

*通信作者：孫寶國（1961—），男，教授，博士，研究方向：食品科學。王昌濤（1975—），男，副教授，博士，研究方向：生物技術。