鎘濃度對烤煙幼苗鎘含量及生長和生理指標的影響

賀 遠，王樹聲，劉海偉，鹿 瑩，2，常 帥,2，石 屹*

(1.農業部煙草生物學與加工重點實驗室,中國農業科學院煙草研究所,青島 266101；2.中國農業科學院研究生院,北京 100081)

鎘濃度對烤煙幼苗鎘含量及生長和生理指標的影響

賀 遠.1,2，王樹聲1，劉海偉1，鹿 瑩1，2，常 帥1,2，石 屹1*

(1.農業部煙草生物學與加工重點實驗室,中國農業科學院煙草研究所,青島 266101；2.中國農業科學院研究生院,北京 100081)

為了探索重金屬鎘對煙草的危害機理，采用水培試驗，調查了不同鎘濃度處理在煙草幼苗各部位不同提取態的鎘含量以及煙草幼苗干物質積累量、根系活力、葉綠素含量、硝酸還原酶活力和丙二醛含量等生理指標的變化。結果表明，煙草根系鎘(Cd)以去離子水提取態為主，其次為醋酸提取態，葉片中 Cd 主要以醋酸結合態存在。隨著鎘濃度的提高，Cd 存在由活性弱的化學形態向活性強的形態轉化的趨勢，干物質量的積累先升高后降低；不同 Cd濃度處理時，煙草幼苗 Cd含量表現為：莖＞根＞葉，隨著 Cd 處理濃度的提高，煙草幼苗中的 Cd 更多的富集在煙苗的根部和莖部。根系活力和葉綠素含量逐漸降低；硝酸還原酶活性呈先升高后降低，丙二醛含量則反之。因此，與對照相比，低濃度Cd處理在一定程度上刺激煙草幼苗的某些生理活性，使其呈現更高的生物活性，但高濃度Cd處理則極顯著抑制煙草幼苗的生長，使其各項生理活動降低，最終影響其正常的生長。

烤煙；鎘；提取；干物質量；葉綠素；生理特性

隨著城鎮化的的發展和農業現代化的推進,農用化肥和農藥種類及用量的增加,土壤重金屬污染日趨嚴重。因鎘(Cd)易被植物吸收,并導致不同的形態、生理、生化和結構的變化,故而其危害尤為突出[1]。Cd 對植物的影響包括光合作用和生長的抑制,減少葉綠素和水分含量,干擾營養物質的吸收,甚至導致植物死亡[2-5]。大量研究表明,Cd 可破壞光合色素的合成,引起光合速率降低,抑制RuBP 竣化酶活性,影響碳固定、PSII 活力,并可誘導細胞膜脂過氧化作用[6-8]。

煙草是我國重要的經濟作物之一[9],是一種對環境極其敏感的作物,同時也是一種 Cd的超富集植物[10]。Cd 在煙草中具有毒性大,污染普遍,易在煙葉中累積,且易揮發,在煙氣中的遷移比例高等特點。控制煙草制品中 Cd的含量在減輕煙草重金屬對人體危害方面意義重大。煙草制品中的 Cd主要來源于煙葉生產過程,土壤是其主要途徑之一[12]。控制 Cd 從土壤向煙草轉移的過程是控制煙葉中Cd含量的有效方法。有關 Cd對農作物的毒害機理,Cd 怎樣通過對植物的生理生化過程的影響造成農作物受害,以及如何降低農田土壤中的Cd污染,不少學者就 Cd對烤煙的大田生長期做了一些研究[13-15],但關于 Cd 對烤煙幼苗生長生理的影響研究較少,同時針對 Cd在煙草中的賦存提取態的研究也鮮有報道。針對上述問題,本研究以栽培面積較廣泛的煙草品種 K326 為試驗材料,采用水培試驗探討不同 Cd濃度處理下烤煙幼苗生長及生理生化的變化,揭示重金屬Cd毒害煙草幼苗的作用機制,以期在生產中獲得優質、低危害的煙苗。

1 材料與方法

1.1 供試材料

煙草品種 K326 由中國煙草種質資源庫提供,水培營養液采用 1/4 濃度的 Hoagland 完全營養液。Cd 溶液以分析純醋酸鎘[(CH3COO)2Cd?3H2O,分析純]配制,設置不添加 Cd(CK)、添加 Cd 10和 500 μmol/L 3 個處理,3 次重復,完全隨機排列。

1.2 煙草幼苗培養

煙草種子經浸泡、滅菌、消毒后于 28 ℃黑暗條件下催芽,發芽后移入石英砂培養基中培養至 6葉1心期,選取大小一致的煙苗,用去離子水沖洗干凈后移至營養液中培養 7 d 后放入不同鎘濃度營養液中培養。煙苗培養所用容器為體積 12 L 的塑料盆,每盆定植3株。煙苗培養在玻璃溫室中進行,白天用通氣泵進行通氣 14 h (6:00—18:00),期間每 2 h 停止通氣 1 h。培養期間每 4 d 更換 1 次營養液,營養液用 0.1 mol/L NaOH 或 0.1 mol/L HCl調節溶液 pH 至 6.0 左右。

1.3 測試項目與方法

干物質質量的測定,取樣后 105 ℃殺青,75 ℃烘干至恒重。Cd 含量的測定采用微波消解,ICP-MS法測定[16]。細胞內各化學提取態的分離,采用化學試劑逐步提取法,具體操作參照 Perronnet 的方法[17]。硝酸還原酶(Nitrate Reductase,NR)活性采用磺胺比色法測定；根系活力采用 TTC法測定；葉綠素(Chlorophyll)含量采用乙醇丙酮提取法測定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[18]測定。

1.4 數據處理

數據采用 SPSS 13.0 按單因素 3 重復完全隨機設計進行統計分析。

2 結 果

2.1 煙草幼苗各部位 Cd 含量

表1是 Cd處理后煙草幼苗各部位Cd含量。可以看出,隨著 Cd 濃度的增加,煙草幼苗中的 Cd含量極顯著地增加,但與 CK 相比,10 μmol/L Cd濃度處理,其莖部和葉片的 Cd含量增加不顯著。在不添加 Cd 處理和 10 μmol/L Cd 處理時,煙草幼苗各部位 Cd 含量為莖＞根＞葉。隨著 Cd 濃度的提高,Cd 主要集中在根部和莖部,在 500 μmol/L Cd處理時,煙草幼苗各部位 Cd 含量莖＞根＞＞葉。

表1 Cd 處理后煙草幼苗各部位 Cd 含量 mg/kgTable 1 Cd content of various parts of tobacco seedling with Cd treatment

2.2 煙草幼苗各部位 Cd 的化學形態分布

從表2可以看出,煙草根系和葉片中 Cd在不添加 Cd 處理和 10 μmol/L Cd 濃度處理時以醋酸提取態和氯化鈉提取態為主；500 μmol/L Cd 處理時以去離子水提取態和醋酸提取態為主。其根系在 500 μmol/L Cd 處理時,去離子水提取態的 Cd 含量最高,而葉片中則以去離子水結合態含量最高。提高Cd處理濃度,Cd存在由活性弱的化學形態向活性強的形態轉化的趨勢。

表2 煙草幼苗中各種提取劑提取的 Cd 含量（鮮基） mg/kgTable 2 The content of various extract Cd in tobacco seedlings

葉片中的Cd含量在不添加Cd處理時主要以氯化鈉提取態、醋酸提取態和鹽酸提取態存在,添加10 μmol/L Cd 濃度處理后,鹽酸提取態含量降低,乙醇提取態和去離子水提取態的比例上升；添加500 μmol/L Cd 處理后去離子水提取態和醋酸提取態所占的比例極顯著的提高。根部在不添加 Cd處理時 Cd主要以醋酸提取態和氯化鈉提取態存在,所占比例分別為 51.8%和 32.0%；添加 10 μmol/L Cd濃度處理后去離子水提取態和乙醇提取態呈極顯著提高(P＜0.01),添加 500 μmol/L Cd 處理后,去離子水提取態極顯著的提高,所占比例達到了59.6%,醋酸提取態比例降低到了 29.4%。

2.3 煙草幼苗干物質積累

煙草幼苗總的干物質量均表現為先略微升高后急劇降低,各處理干物質量均表現為:葉＞根＞莖。莖部干物質重則在低濃度時與對照持平,高濃度時降低,葉片的干物質重表現為持續降低。Cd濃度為10 μmol/L 時根部的干物質重與對照之間差異不顯著(圖 1),Cd 濃度達到 500 μmol/L 時其干物質重量極顯著低于對照處理,各處理間幼苗莖部的干物質重差異不顯著,Cd 濃度為 10 μmol/L 時葉片的干物質重與對照差異不顯著,500 μmol/L Cd 濃度處理下煙草幼苗的葉片干物質重極顯著低于對照。

圖1 鎘對煙草幼苗干物質重量的影響Fig. 1 Influence of Cd on dry matter weight of tobacco seedling

整株干物質重,鎘 500 μmol/L 與對照與 10 μmol/L Cd 處理差異均達到極顯著水平,但對照與10 μmol/L Cd 濃度處理間差異不顯著。

2.4 煙草幼苗葉綠素及類胡蘿卜素含量

從圖 2可以看出,葉綠素 a、葉綠素 b和總葉綠素含量隨著 Cd濃度的增加顯著降低,其中葉綠素 a 降幅最大,達到了 37.65%,而葉綠素 b 和總葉綠素含量的降低幅度分別達到了 34%和 36.78%。類胡蘿卜素含量處理間無顯著差異。

2.5 煙草幼苗其他生理指標

與對照相比,添加 10 μmol/L Cd 時,根系活力并沒有受到顯著影響(圖 3A),添加 500 μmol/L-Cd 時,根系活力顯著降低,降幅達 44.89%,此說明添加大量的 Cd會引起根系活力顯著下降,但少量 Cd(10 μmol/L)并不會影響根系活力。

從圖 3B 可以看出,與對照相比,添加 10 μmol/L Cd使硝酸還原酶活性顯著增加,但過高的 Cd會造成硝酸還原酶活性顯著下降。

圖 3C 顯示了鎘對煙草幼苗葉片丙二醛含量的影響,可以看出 10 μmol/LCd 濃度處理下煙草幼苗丙二醛含量與對照相比降低了 8.52%,但是兩者差異未達顯著水平。當 Cd 濃度提高到 500 μmol/L 時,煙草幼苗丙二醛含量比對照高出 35%,但差異未達到5%顯著水準。

圖2 煙草幼苗葉綠素會類胡蘿卜素含量Fig. 2 Influence of Cd concentration on chlorophyll and carotenoid content in tobacco leaves

圖3 煙草幼苗根系活力(A)，硝酸還原酶活性(B)和丙二醛含量(C)Fig. 3 Root activity(A)，NR activity (B) and MDA(C) content of tobacco seedling

3 討 論

Cd在煙株地上和地下部的分配模式在不同作物中存在較大差異。Wagner 等[19]通過水培試驗發現,普通煙草主要將 Cd儲存在葉片和根部。袁祖麗[20]通過盆栽試驗發現,當土壤中 Cd 的添加量為3～6 mg/kg 時,根中 Cd 的含量要略高于葉片中 Cd的含量,隨著 Cd污染程度的繼續增加,葉片中的Cd 含量才高于根。Clark[21]通過盆栽試驗研究了 16個煙草品種在不同污染條件下 Cd的分配情況,發現在未添加外源 Cd 的情況下,葉、莖和根中 Cd的含量分別為 0.7、0.3 和 0.21 mg/kg,當向土壤添加 0.25 mg/kgCd 后,Cd 含量分別增至 86.9、14.5和 21.2 mg/kg。本研究結果表明:在不添加 Cd 處理和 10 μmol/LCd 處理時,煙草幼苗各部位 Cd 含量表現為:莖＞根＞葉,在 500 μmol/LCd 處理時,煙草幼苗各部位 Cd 含量表現為:莖＞根＞＞葉,這表明隨著Cd濃度的提高,Cd主要被富集在根部和莖部。

Cd 在各作物不同部位提取態存在較大差異,圓錐南芥葉片中以水提取態 Cd為主,根系中乙醇提取態 Cd 的含量最高；當 Cd 提高到 10 mg/L 時,葉片和根系中 Cd 均以 NaCl提取態含量最高,說明隨著Cd濃度的增加,Cd與蛋白質、果膠酸等形態結合是圓錐南芥減輕 Cd 毒害的主要機制[22]。田陽陽等[23]在對煙草中 Cd 賦存形態的研究表明,煙草根系中Cd以乙醇提取態為主,葉片中Cd主要以氯化鈉結合態和去離子水結合態存在。提高 Cd處理濃度,Cd存在由活性強的化學形態向活性弱的形態轉化的趨勢。本研究的結果表明,隨著 Cd濃度的提高,Cd存在由活性弱的化學形態向活性強的形態轉化的趨勢,這與前人的研究存在較大差異。而李彥娥等[24]的研究表明根部醋酸提取態分配比例最高,葉片中氯化鈉提取態分配比例最高,這與本文的研究存在差異。。

Cd并非煙草生長所需的必需元素,但卻易于被煙草吸收并且 Cd脅迫明顯抑制烤煙的生長,且隨濃度增加其抑制程度加重。有研究表明,鎘脅迫對煙草生長發育造成嚴重的傷害,如顯著降低葉片葉綠素含量,增加MDA含量等,同時降低葉片氨基酸含量等[25-26],還有研究表明[27],Cd 脅迫對作物生長發育造成嚴重的傷害,能夠顯著的降低作物的生物量,這與本試驗的研究結果一致。隨著 Cd濃度的升高,煙草幼苗的干物質重量明顯下降,但是本研究發現低濃度的 Cd處理能增加煙草幼苗根部的干物質量,表明低濃度的 Cd處理刺激了煙草幼苗根系的生長。

受Cd危害的植物,其葉綠體的合成受到影響,葉綠體提取量下降,對植物的光合作用將產生不利影響[28]。本研究的結果更加詳細的探討了葉綠素 a、b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量隨著Cd濃度的變化而發生的變化,Cd 對葉綠素 a、b 和總葉綠素的影響均達到顯著水平且葉綠素 a/b 的值呈現降低的趨勢,這與馬新明的研究一致[29],只有在較高的 Cd濃度處理下,類胡蘿卜素的含量才顯著下降,這點與前人的研究不盡相同。在本試驗中,隨 Cd濃度的升高,煙草幼苗的長勢越來越差,葉片出現黃化現象并且隨著處理時間的延長,煙草幼苗出現萎焉現象并伴有根尖黑點,這與郭江波[30]的研究相近。有研究指出隨著 Cd濃度的提高,植物的根系活力逐漸降低[31],本研究的結果與之相一致。硝酸還原酶是植物氮代謝過程中的關鍵酶,主要存在于葉綠體和前質體中,其活性的高低直接影響植物的氮同化速率。本研究表明,在低濃度鎘處理下,煙草幼苗的硝酸還原酶活性略微的升高而后隨著鎘濃度的提高呈現降低趨勢,這與張秋銀等[32]的研究一致。膜脂過氧化產物丙二醛(MDA)的含量是反映細胞膜過氧化作用強弱的一個指標。作物受 Cd脅迫后,體內 MDA含量顯著增加,質膜透性增大,作物生長受到顯著的抑制[33],本研究的結果證實了這一點,但在本研究中,在 10 μmol/L Cd 處理時煙草幼苗的 MDA 含量出現了微量的減少,而后在 500 μmol/LCd 處理時則急劇降低,其原因有待進一步的研究。

4 結 論

本研究表明,在不添加Cd處理時,Cd主要集中在煙草的莖部,隨著 Cd濃度的增加,葉片中Cd的積累量增加,但是 Cd主要還是積累在根部和莖部。煙草根系中 Cd以去離子水提取態為主,其次為醋酸提取態,葉片中Cd主要以醋酸結合態存在,提高Cd處理濃度,活性強 Cd化學形態所占比例升高。Cd抑制了煙草幼苗的生長,降低了煙草幼苗各項生理活性,使其碳氮代謝受到嚴重影響。低濃度的 Cd處理在一定程度上能使煙草幼苗根部干物質重增加,葉片硝酸還原酶活性增強。綜合本研究結果,我們認為要降低煙草中的 Cd含量,必須在苗期嚴格控制重金屬對幼苗的污染,在烤煙生產中栽種優質、低危害的煙苗。

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Effect of Cd Concentration on Cd Content and Growth and Physiological Indices of Tobacco Seedlings

HE Yuan1,2, WANG Shusheng1, LIU Haiwei1, LU Ying1,2, CHANG Shuai1,2, SHI Yi1*
(1. Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing, Ministry of Agriculture, Tobacco Research Institute, CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100049, China)

In order to explore the damage mechanism of cadmium (Cd) on tobacco, effects of cadmium with different concentrations on the growth and the physiological and biochemical activities of tobacco were studied by solution culture. The results showed that the growth of tobacco plant was restrained under the cadmium stress. Acetic acid -extractable Cd was the main chemical form of Cd in root system. In leaves, Cd mainly existed in the forms of binding to Acetic Acid and deionized water. With the increase of Cd concentration, Cd tended to transform from low activity to high activity. The Cd content in different parts of tobacco seedlings under different Cd treatment was∶ stem ＞ root ＞ leaf. The chlorophyll content, nitrate reductase activity, root activity and MDA content changed under different cadmium treatment to tobacco seedlings. With the increase of cadmium concentration, the dry matter accumulation increased firstly and then decreased, chlorophyll content and root activity showed a gradual decreasing trend, nitrate reductase activity increased firstly and then decreased, and MDA content decreased first and then increased. This study suggest that low concentrations of Cd can stimulate tobacco biological activity, but high concentrations of Cd can significantly inhibite the growth of tobacco seedlings, reduce the physiological activity, and ultimately affect their normal growth.

tobacco; cadmium, extract, dry matter weight, chlorophyll, physiological index

S572.043

1007-5119(2014)02-0037-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.02.007

國家煙草專賣局特色優質煙葉開發重大科技專項“低危害煙葉開發”(Ts-06-20110037)；國家煙草專賣局創新平臺經費專項(201304)；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(22060302)

賀 遠,博士研究生,研究方向為植物生理與作物營養。E-mail:heyuan818@163.com。*通信作者,E-mail:qdshiyi0@163.com。

2014-02-16

2014-04-10