錳-超氧化物歧化酶、過氧化氫酶在異丙腎上腺素所致大鼠心肌肥厚中的表達

朱玉林，米立國，郝連軍，杜建文，王瑞芬

(1.河北省邯鄲市婦幼保健院麻醉科，河北 邯鄲 056001；2.河北醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室，河北 石家莊 050017；3.河北省血液中心檢驗科，河北 石家莊 050071；4.河北省承德市中心醫院超聲診斷科，河北 承德 067000；5.河北省滄州市中心醫院兒科，河北 滄州 061000)

心肌肥厚(myocardial hypertrophy)是心臟對慢性壓力或容量超負荷等因素所作出的一種代償性反應[1-2]。大量研究[3]表明氧化應激可能是導致心肌肥厚的重要原因。在心肌肥厚的形成和發展過程中，活性氧族(reactive oxygen species，ROS)產生增多[4]。過多的ROS如不被機體及時清除，就會損害心肌細胞內的蛋白質和脂類等生物大分子引起細胞死亡[5]。錳-超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutases，Mn-SOD)主要負責清除線粒體內的超氧陰離子[6-7]；過氧化氫酶(catalases，CAT)主要負責清除細胞內的過氧化氫[8-9]。CAT與Mn-SOD是維持心肌正常功能所必需的抗氧化酶。以前的研究只觀察了Mn-SOD 和CAT在心肌肥厚模型中蛋白活性的改變，均未對這兩個重要抗氧化酶系基因水平的表達變化進行觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和取材：健康雄性SD大鼠16只，體質量(300±10)g，隨機分為對照組(Control組)和心肌肥厚模型組(Iso 組)。參照Borges等[10]的方法,Iso組大鼠通過背部皮下注射異丙腎上腺素(5mg·kg-1·d-1),連續注射7 d制備大鼠心肌肥厚模型；對照組大鼠背部皮下只注射等體積的生理鹽水。兩組大鼠均自由進食進水。末次給藥24h后稱量大鼠體質量(body weight,BW),6%水合氯醛(5mL/kg體質量)腹腔注射麻醉。分離右側頸總動脈插入自制聚乙烯導管，穩定后記錄右頸總收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP),計算平均動脈壓(mean aterial pressure,MAP)；收集大鼠血液，3 000r/min離心10min,分離血清，用于血清乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase，LDH) 活性測定；開胸取心稱量左心及全心質量、測量左心室壁厚度。此外，將一部分心臟標本放入液氮中用于總RNA的提??；另一部分放入固定液內固定，用于光鏡和透射電鏡觀察。

1.2 主要試劑：LDH測定試劑盒為中生北控生物科技公司產品，TRIzol、RT試劑盒、Taq DNA聚合酶均為Invitrogen公司產品。

1.3 血壓測量：麻醉后固定大鼠，分離右側頸總動脈，插入和壓力換能器相連的自制聚乙烯導管，穩定后記錄右頸總動脈SBP、DBP，計算MAP=(SBP+DBP×2)/3。

1.4 LDH活性測定:LDH活性按照試劑盒的操作說明采用乳酸脫氫酶-乳酸(lactate dehydrogenase-lactate,LD-L)速率法測定。

1.5 測量心質量及左心室壁厚度:大鼠麻醉后開胸取心，用鑷子輕壓心體擠出內部殘留血液并用冷生理鹽水洗掉表面血液，濾紙拭干后迅速置于電子天平內稱量全心質量(heart weight,HW)，再迅速分離左心室稱量質量(left ventricle of heart weight,LHW)，計算心質量指數(HW /BW，LHW/BW)。打開左心室分離室間隔(interventricular septum，VST)與游離心室壁(left ventricular wall thickness,LVWT)，用游標卡尺測量其厚度。

1.6 心肌的光鏡和透射電鏡觀察： 按照光鏡與透射電鏡的要求進行樣品制備，分別于光鏡與透射電鏡下觀察心肌纖維形態變化,并進行圖像分析。

1.7 Mn-SOD、CAT的mRNA測定：用TRIzol法提取心肌總RNA。以GAPDH為內參照，進行RT-PCR。分別以Mn-SOD、CAT和GAPDH的擴增產物的灰度值之比表示其mRNA的相對表達量。GAPDH引物，上游，5′GCTGAGTATGTCGTGGAGT 3′，下游，5′TCTTCTGAGTGGCAGTGAT 3′；Mn-SOD引物，上游，5′TGACCTGCCTTACGACTA 3′，下游，5′CGACCTTGCTCCTTATTG 3′；CAT引物，上游，5′TATTGCCGTCCGATTCTC 3′，下游，5′ATGCCCTGG-TCAGTCTTG3′。

2 結 果

2.1 血壓：與對照組相比，Iso 組大鼠血壓明顯升高(P<0.01)，見表1。

2.2 LDH活性：與對照組相比，Iso 組大鼠血清LDH活性明顯升高(P<0.01)，見表1。

2.3 HW /BW與LHW/BW的改變：與對照組相比，Iso 組大鼠的HW/BW與LHW/BW均明顯增加(P<0.01)，見表1。

2.4 VST與LVWT的改變：與對照組相比，Iso組大鼠的VST與LVWT均明顯增加(P<0.01)，見表1。

2.5 心肌組織的光鏡觀察：Iso組大鼠心肌組織的HE染色切片在光鏡下可見大片纖維化區域，成纖維細胞多，偶可見單核細胞，局部區域毛細血管擴張，心肌細胞排列不連續，胞漿變寬,胞核變大,呈現明顯的心肌肥厚纖維化表現(圖1)。對照組大鼠的心肌纖維排列整齊，心肌細胞胞核清晰，無膠原纖維增生(圖2)。

2.6 心肌組織的透射電鏡觀察：對照組大鼠心肌纖維明帶、暗帶結構清晰，肌節長度適中，肌纖維排列整齊，線粒體數量結構未見異常(圖3)。心肌肥厚模型組大鼠線粒體數量較多，線粒體嵴增多密集，線粒體腫脹，個別線粒體出現空泡樣變，心肌纖維內肌絲有溶解現象，心肌纖維間隙增寬、成纖維細胞明顯，間隙內出現凋亡細胞(圖4～6)。

2.7 Mn-SOD、CAT的 mRNA表達變化：與對照組相比，Iso組大鼠心肌組織內Mn-SOD、CAT的mRNA表達水平均明顯增強(P<0.05)，見表2。

GroupsMAP(kPa)LDH (U/L)HW/BW(mg/g)LHW/BW(mg/g)LVWT(mm)VST(mm)Control10.21±0.81514.83±13.433.05±0.232.33±0.113.56±0.182.44±0.07Iso14.05±1.19?876.66±9.52?4.51±0.39?3.26±0.25?4.33±0.31?3.11±0.19?

*P<0.01vscontrol group byttest

MAP:mean arterial pressure;LDH:lactate dehydrogenase;HW/BW:heart weight/body weight;LHW/BW:left ventricle of heart weight/body weight;LVWT：left ventricular wall thickness;VST:interventricular septum;Iso:isoproterenol

GroupsMn-SODCATControl0.625±0.0950.763±0.129Iso0.998±0.154?1.051±0.143?

*P<0.05vscontrol group byttest

Mn-SOD:manganese superoxide dismutases;CAT:catalases;Iso:isoproterenol

3 討 論

心肌肥厚是多種心血管疾病所具有的共同病理過程，如不及時治療會發展成心功能衰竭。因此，對心肌肥厚發病機制的探討一直是心血管研究的重點之一。到目前為止，對于其發病機制的研究主要是通過動物模型來實現的。Iso是一種β受體激動劑，可增強心肌收縮力，加快心率，使心肌耗氧量明顯增加，并能促進心肌細胞總蛋白和非收縮蛋白合成,使心肌細胞肥大，膠原纖維增生，導致心肌肥厚的形成[11-12]。本研究結果顯示，在給大鼠注射7d Iso后，HE和電鏡結果均提示大鼠出現心肌肥厚的病理改變；同時，Iso組大鼠的血壓升高，HW/BW、LHW/BW、LVWT、VST等均明顯增加，進一步證實心肌肥厚的發生；此外，血清內LDH活性明顯升高，說明此時心肌細胞已嚴重受損，導致釋放入血的LDH增多，活性升高。以上這些結果均表明使用Iso誘導的心肌肥厚模型是成立的。

在心肌肥厚的發生發展過程中，心肌細胞消耗的能量明顯增強。機體通過加強線粒體氧化磷酸化來增加三磷酸腺苷的合成，滿足心肌過多的能量消耗。但在這個過程中從電子傳遞鏈泄漏的ROS也會隨之增多。它們可以使生物膜內的多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應,改變生物膜的結構和功能。此外，ROS還可損傷線粒體的結構和功能,使三磷酸腺苷合成減少,加重心肌能量缺乏,進一步促進心肌肥厚的發生發展。這可能是我們建立的大鼠心肌肥厚模型出現明顯的心肌細胞受損、心肌肥厚纖維化等病理改變的直接原因。同時，Mn-SOD和CAT的mRNA表達水平在心肌肥厚模型組大鼠明顯增強。推測：當心肌肥厚等病理改變發生后，心肌組織內ROS的產生量明顯增多，此時機體通過上調Mn-SOD、CAT的基因表達水平，增加其生成量來清除過多的ROS，保護心肌細胞免遭損傷，防止心肌肥厚的進一步發展。本研究結果進一步證實了SOD和CAT 2個抗氧化酶在心血管疾病防治中的重要作用，這將為心肌肥厚防治方法的研究提供一定的理論參考。(本文圖見封二)

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