那可丁對人卵巢癌SKOV3細胞增殖和凋亡的影響

申 薇，梁冰鋒，秦秀紅，秦金金，黃軍巖，程建新*

(1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050011；2.河北女子職業(yè)技術(shù)學院護理系，河北 石家莊 050091)

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，嚴重威脅女性健康。目前關(guān)于卵巢癌的治療，除手術(shù)外，以紫杉醇、順鉑等為主的聯(lián)合化療是主要治療手段[1]。然而由于化療藥物在血液、神經(jīng)等方面的不良反應(yīng)，以及多藥耐藥性的產(chǎn)生，嚴重影響了藥物的化療效果和臨床療效。因此，有必要尋找不良反應(yīng)小的抗腫瘤藥物來改善卵巢癌的治療效果，以提高患者的生存質(zhì)量[2]。那可丁是一種來自于鴉片的鄰苯二甲酸異喹啉生物堿，結(jié)構(gòu)與秋水仙堿相似，一直作為鎮(zhèn)咳藥使用。那可丁能夠與微管蛋白相結(jié)合，使微管蛋白的動態(tài)性能得以改變，進而延長了腫瘤細胞周期有絲分裂的靜止期，達到抗腫瘤活性的作用，可抑制多種惡性腫瘤細胞的生長[3]。本實驗采用體外培養(yǎng)的人卵巢癌SKOV3細胞株作為研究對象，檢測那可丁對細胞增殖、凋亡及成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)表達的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器:注射用順鉑購自山東齊魯制藥廠，那可丁、胰蛋白酶、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染液購自美國Sigma公司，磷酸緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、RPMI l640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自天津化學試劑廠，胎牛血清購自杭州四季青公司，四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購自洛陽華美生物工程公司，F(xiàn)GF-2兔抗人單克隆抗體購自美國Epitomics公司。流式細胞儀，Epics-XLⅡ型，美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)；酶標儀，HT2-125500型，鄭州博賽生物工程公司生產(chǎn)。

1.1.2 細胞株:人卵巢癌SKOV3細胞株由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心提供。將人卵巢癌SKOV3細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶內(nèi)單層傳代培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖抑制率：取對數(shù)生長期的SKOV3細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細胞密度為2.5×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，200μL/孔(含5×103個細胞)，每組設(shè)3個平行孔，分為加生理鹽水的對照組和那可丁(5、10、20、40、80、160μmol/L)組。細胞培養(yǎng)24、48和72h后，加入MTT(5g/L)20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去上清液，加入DMSO(200μL/孔)，振蕩10min使結(jié)晶充分溶解。用酶標儀測其在490nm波長處的吸光度(optical delnsity，OD)值，按以下公式計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài):取對數(shù)生長期的SKOV3細胞，分為加生理鹽水的對照組和那可丁(10、20、40μmol/L)組，細胞培養(yǎng)48h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學變化。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡率:取對數(shù)生長期的SKOV3細胞，分為加生理鹽水的對照組和那可丁(10、20、40μmol/L)組，培養(yǎng)48h后收集細胞，用無菌冷PBS離心洗滌3次，輕輕振蕩后，加70%酒精固定，4℃保存過夜。PBS離心洗滌細胞3次，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，取1mL細胞懸液，加入PI染液，使其終濃度達到50mg/L PI，4℃避光染色30min后上流式細胞儀檢測。分別應(yīng)用Muticycle AV軟件和Expo ADC軟件對細胞周期的時相分布和細胞凋亡情況進行分析。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞的蛋白表達：取對數(shù)生長期的SKOV3細胞，分為加生理鹽水的對照組和那可丁(10、20、40μmol/L)組，培養(yǎng)48h后收集細胞，用無菌冷PBS離心洗滌3次，輕輕振蕩后，加70%酒精固定，4℃保存過夜。用PBS離心洗滌細胞2次，沉淀細胞后溶于100μL PBS，分別加入FGF-2兔抗人單克隆抗體100μL，避光靜置60min，加入鼠抗兔二抗工作液100μL，對照組只加二抗。避光靜置60min，流式細胞儀檢測SKOV3細胞中蛋白的表達量，以平均熒光強度表示蛋白的含量。

2 結(jié) 果

2.1 那可丁對卵巢癌SKOV3細胞的增殖抑制作用：隨著藥物濃度的增加，細胞的增殖抑制率總體呈增高趨勢，但那可丁劑量組中40、80、160μmol/L組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。那可丁作用于SKOV3細胞24h的半數(shù)細胞增殖抑制濃度(inhibitory concentration 50,IC50)為46.77μmol/L，作用48h的IC50為22.66μmol/L，作用72h的IC50為19.08μmol/L，細胞的增殖抑制率隨著作用時間的延長而增強(圖1)。表明那可丁對SKOV3細胞的抑制存在時間和濃度依賴效應(yīng)。

2.2 那可丁對卵巢癌SKOV3細胞形態(tài)的影響：對照組卵巢癌SKOV3細胞圓亮飽滿，排布緊密，呈菱形或梭形，細胞間界限清楚并隱約可見細胞核。那可丁作用SKOV3細胞后，可見到部分細胞變小變圓、皺縮、破裂、脫落呈懸浮狀，并見到細胞碎片，且那可丁濃度越高上述細胞形態(tài)學變化越明顯(圖2)。

圖1 卵巢癌SKOV3細胞的增殖抑制率

Figure 1 The growth inhibition rate on human ovarian cancer SKOV3 cells

圖2 卵巢癌SKOV3細胞形態(tài)學變化(×100)

A.對照組；B.20μmol/L那可丁組；C.40μmol/L那可丁組

Figure 2 The morphological changes of human ovarian cancer SKOV3 cells (×100)

A.Control group;B.20μmol/L narcotine group;C.40μmol/L narcotine group

2.3 那可丁對卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響：與對照組SKOV3細胞凋亡率(2.87±0.94)%比較，10μmol/L那可丁組凋亡率(3.59±2.83)%差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，20、40μmol/L那可丁組凋亡率分別增加至(10.59±2.99)%、(19.67±4.01)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著那可丁治療濃度的增加，細胞凋亡率逐漸增高，各劑量組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明那可丁能夠誘導細胞凋亡，并具有劑量依賴性。

2.4 那可丁對卵巢癌SKOV3細胞周期的影響：與對照組相比，10μmol/L那可丁對SKOV3細胞周期無明顯影響，而20μmol/L、40μmol/L 那可丁分別使G0/G1期細胞比例減少17.9%、48.6%，G2/M期細胞比例增加33.6%、89.7%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著那可丁濃度的增加，G0/G1期細胞比例逐漸降低，G2/M期細胞比例逐漸升高，40μmol/L那可丁組與10、20μmol/L那可丁組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。表明那可丁對SKOV3細胞具有G2/M期阻滯作用。

GroupsG0/G1SG2/M Control61.77±4.9721.36±3.6116.87±2.6510μmol/L narcotine54.45±6.7627.94±6.1217.61±4.2120μmol/L narcotine 50.73±2.66?26.67±2.7822.53±2.53?40μmol/L narcotine31.77±9.38?#36.27±10.8732.00±1.80?#

*P<0.05vscontrol group #P<0.05vs10,20μmol/L narcotine groups byANOVA

2.5 那可丁對卵巢癌SKOV3細胞FGF-2蛋白表達的影響：對照組FGF-2蛋白表達量為287.05±10.55，10、20、40μmol/L那可丁組蛋白表達量分別為284.56±6.33、268.78±7.56、250.72±5.21。與對照組相比，10μmol/L那可丁對FGF-2蛋白表達無顯著影響，20、40μmol/L那可丁使FGF-2蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著那可丁濃度的增加，F(xiàn)GF-2蛋白表達逐漸降低，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

目前臨床上常用的微管蛋白抑制劑為長春新堿、紫杉醇等，雖然其療效顯著，但這類藥物有毒性大、水溶性低的特點，并可導致脫發(fā)、骨髓抑制、神經(jīng)病變以及胃腸道毒性等多種不良反應(yīng)。那可丁也可作用微管，可使腫瘤細胞的紡錘體較早的滅活，導致細胞無法進行有絲分裂并引起腫瘤細胞死亡。那可丁不僅可以抑制非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌等多種癌細胞的增殖，而且對一些紫杉醇耐藥細胞也有較好的抑制作用。本實驗結(jié)果顯示，那可丁明顯抑制SKOV3細胞生長，并呈劑量和時間依賴性；那可丁作用于SKOV3細胞24、48、72h的IC50值分別為46.77、22.66、19.08μmol/L，與非小細胞肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、膠質(zhì)細胞瘤的IC50值并不相同。表明那可丁對不同腫瘤細胞作用的敏感性也不一樣[4]。進一步研究發(fā)現(xiàn)那可丁可誘導SKOV3細胞凋亡，那可丁作用后的SKOV3細胞變小皺縮，細胞間連接減少，細胞脫落呈懸浮狀，見到細胞碎片，并出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學改變。

細胞分裂的最主要環(huán)節(jié)是紡錘體和微管之間的互變，干擾這一過程的抗微管化合物均能夠阻滯腫瘤細胞的有絲分裂和細胞增殖，進而誘導腫瘤細胞的死亡[5]。那可丁作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞后，可使細胞周期素B1的表達增加，磷酸化細胞周期蛋白依賴性激酶表達水平減少，這些周期蛋白的改變與有絲分裂受損引起細胞死亡時蛋白的改變一致，證實那可丁在調(diào)節(jié)有絲分裂過程中起重要作用[6]。FGF-2是一種具有多種生物活性的細胞分裂促進因子，在細胞周期的轉(zhuǎn)換中誘導并促進G0/G1期細胞進入S期，發(fā)揮促進細胞有絲分裂、生長和增殖的作用。FGF-2在卵巢癌患者癌細胞內(nèi)高表達，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。本實驗結(jié)果顯示，那可丁可將SKOV3細胞阻滯于G2/M期，并降低細胞內(nèi)FGF-2蛋白的表達，可能是那可丁誘導細胞的作用機制之一。

總之，那可丁具有抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖并誘導其凋亡的作用，其機制可能與SKOV3細胞G2/M期阻滯和FGF-2蛋白表達下調(diào)有關(guān)。

[1] 彭傳真,趙永利,宋兆錄,等.紫杉醇聯(lián)合奈達鉑與紫杉醇聯(lián)合順鉑治療晚期卵巢上皮性癌66例臨床分析[J].河北醫(yī)科大學學報,2010,31(11): 1369-1370.

[2] 梁夢,周英瓊,肖勝軍,等.甲基蓮心堿對人卵巢癌順鉑耐藥逆轉(zhuǎn)的體外研究[J].山東醫(yī)藥,2011,51(1): 39-41.

[3] MAHMOUDIAN M,RAHIMI-MOGHADDAM P.The anti-cancer activity of noscapine: a review[J].Recent Pat Anticancer Drug Discov,2009,4(1): 92-97.

[4] 戴厚玲,鄭劍斌,林敏,等.那可丁衍生物合成及其作為微管干擾藥物的生物學評估[J].藥學學報,2012,47(10): 1347-1357.

[5] 張素領(lǐng),李貴霞,張麗霞,等.紫杉醇脂質(zhì)體誘導骨肉瘤細胞MG-63凋亡及其機制的研究[J].河北醫(yī)科大學學報,2013,34(1): 40-43,封三.

[6] NEWCOMB EW,LUKYANOV Y,SMIRNOVA I,et al.Noscapine induces apoptosis in human glioma cells by an apoptosis-inducing factor-dependent pathway[J].Anticancer Drugs,2008,19(6): 553-563.

[7] 封全靈,史惠蓉,喬麗娟,等.人成纖維細胞生長因子類似表達基因和成纖維細胞生長因子2在上皮性卵巢腫瘤組織中的表達[J].中華腫瘤雜志,2011,33(10): 770-774.