苦參堿抑制人骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖的實(shí)驗研究

李國慧，劉瑞花，李貴霞，張麗霞

(1.河北省兒童醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050031;2.河北省老年病醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050011；3.河北省兒童醫(yī)院成人科，河北 石家莊 050031)

骨肉瘤，又稱成骨肉瘤，是青少年最常見的惡性成骨性腫瘤之一，該瘤惡性程度高，預(yù)后極差。以大劑量化療為主的綜合治療效果并不理想，且不良反應(yīng)大。苦參堿作為藥用植物在我國據(jù)文字記載已有2 000多年的歷史，目前在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，有關(guān)苦參堿抗腫瘤作用也受到了人們的廣泛關(guān)注。本研究初步觀察了苦參堿對骨肉瘤MG63細(xì)胞生長、增殖的影響，旨在為苦參堿抗腫瘤作用的臨床應(yīng)用提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人骨肉瘤MG63細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院實(shí)驗中心保存，提供使用。MG63細(xì)胞生長在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基37℃飽和濕度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后用于實(shí)驗。

1.2 倒置相差顯微鏡下觀察：將MG63細(xì)胞接種于放有蓋玻片的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，換用含有不同濃度苦參堿的新鮮培養(yǎng)基，定時鏡下觀察并照相。

1.3 四甲基偶氮唑藍(lán)實(shí)驗：取對數(shù)生長期A21-2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，每孔200μL接種于96孔板，培養(yǎng)24h后吸去培養(yǎng)液，加入含藥的培養(yǎng)液，分別設(shè)對照組(不含藥培養(yǎng)基)和不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L)苦參堿組，每組設(shè)10個復(fù)孔。分別培養(yǎng)48、72h，培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入20μL四甲基偶氮唑藍(lán)(5g/L)，37℃繼續(xù)孵育4h(藥物繼續(xù)作用)，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，在振蕩器上振蕩15min，用全自動酶標(biāo)儀(測定波長492nm，參考波長630nm)測定各孔吸光度(A)值計算細(xì)胞生長抑制率并計算IC50值以及相關(guān)系數(shù)(r)。細(xì)胞生長抑制率(%)=(A對照-A實(shí)驗)÷A對照×100%

1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測定caspase-3mRNA的表達(dá)

1.4.1 細(xì)胞總RNA的提取：將按上述分組干預(yù)過的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，每瓶加入TRIZOL 1mL，冰上振蕩裂解15min，將瓶內(nèi)液體移入離心管內(nèi)，分別加入0.2mL氯仿，顛倒混勻，4℃，12 000r/min離心15min，小心吸取上層水相移入另一離心管內(nèi)，加入異丙醇0.5mL混勻，靜置30min,4℃，12 000r/min離心10min，棄上清，沉淀用75%乙醇洗兩遍，干燥后用30μL DEPC水溶解，取5μL，用紫外分光光度計測其RNA濃度。

1.4.2 cDNA的合成：取總RNA5μg，在70℃變性10min后，加入1μL 10 mmol/LdNTP，4μL 3U RNA酶抑制劑，1μL 50ng/μL 隨機(jī)引物，2μL(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶，4μL(5×AMV)緩沖液，用超純水補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)條件為25℃ 10min，42℃ 1h，95℃ 5min，得到cDNA。

1.4.3 聚合酶鏈反應(yīng)：反應(yīng)總體積為20μL，包括4μL cDNA，25mmol/L MgCl21.5μL，0.5U Taq酶1μL，10μmol/L引物各0.7μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，10×buffer 0.8μL，用超純水補(bǔ)足到20μL。聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)條件，94℃預(yù)變性5min，94℃30s，56℃退火30s，72℃延伸45s,30個循環(huán)，72℃復(fù)性5min。引物由北京奧科生物技術(shù)公司設(shè)計合成。Caspase-3引物序列上游，5′-TTCAGAGGGGATC-GTTGTAGAAGTC-3′；下游，5′-CAAGCTTGTCGGCATAC-TGTTTCAG -3′(265bp)；β-actin上游，5′-GACAGGCA-GAAGGAGATTACTG-3′；下游，5′-GCTGATCCACAT-CTGCTGGAA-3′(142bp)。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰氨凝膠電泳，溴化乙錠顯色，Bio-profif 凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像分析。通過caspase-3/β-actine灰度比值作相對定量。

2 結(jié) 果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果：鏡下可見對照組細(xì)胞貼壁生長，呈梭形或多角形，核圓形，胞漿透亮，細(xì)胞增殖狀態(tài)良好(圖1A)。0.6g/L的苦參堿干預(yù)MG63細(xì)胞72h后見部分細(xì)胞脫落，懸浮于培養(yǎng)基中，在貼壁生長的細(xì)胞中有少數(shù)可見膜破裂呈壞死狀。且高濃度組比低濃度組效果更明顯(圖1B)。

圖1苦參堿作用MG63細(xì)胞72h后倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果

A.對照組細(xì)胞( ×20);B.0.6g/L苦參堿作用72h后( ×20)

Figure 1 The morphological changes of MG63 cells treated with matrine for 72h

A.Control cells( ×20);B.Cells treated with 0.6g/L matrine ( ×20)

2.2 四甲基偶氮唑藍(lán)實(shí)驗結(jié)果：各濃度苦參堿對MG63細(xì)胞的生長均具有抑制作用，且隨著苦參堿濃度的增高，作用時間的延長，抑制率也隨著增加，當(dāng)應(yīng)用1g/L苦參堿處理MG63細(xì)胞72h后，其增殖抑制率達(dá)到71.16%，顯示出較強(qiáng)的增殖抑制作用。苦參堿作用48h的IC50為1.019g/L。苦參堿作用72h的IC50為0.701g/L，且藥物濃度與抑制率之間呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系(r=0.979 7,P<0.01)。不同濃度處理組間的比較表明不同濃度苦參堿對細(xì)胞的生長抑制作用差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。并且相同濃度苦參堿，隨著時間的延長，抑制作用明顯增強(qiáng)，具有良好的時效關(guān)系(表1)。

Matrine concentrations (g/L)48hMTT-A valueInhibitory rate (%) 72hMTT-A valueInhibitory rate (%) 0(control)0.225±0.0220.290±0.0230.20.196±0.010?8.990.256±0.009?11.890.40.182±0.010?15.270.236±0.018?18.640.60.155±0.006?27.700.170±0.009?41.350.80.137±0.008?36.270.101±0.011?65.131.00.104±0.004?51.770.084±0.013?71.16

*P<0.01vscontrol group byANOVA

2.3 Caspase-3 mRNA表達(dá)情況：由反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的聚丙烯酰氨凝膠電泳圖可以觀察到，經(jīng)0.4、0.6、0.8g/L的苦參堿處理的MG63細(xì)胞72h后，與對照組相比caspase-3的條帶明顯變亮，由MG63細(xì)胞得caspase-3mRNA/β-actin比值分別為0.519±0.105、0.754±0.173、0.973±0.165，與對照組0.131±0.107比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。

圖2 苦參堿作用MG63細(xì)胞72h后caspase-3 mRNA 的表達(dá)分析

標(biāo)記條帶：標(biāo)記DNA；條帶1：對照組；條帶2：苦參堿濃度為0.4g/L；條帶3：苦參堿濃度為0.6g/L；條帶4：苦參堿濃度為0.8g/L

Figure 2 Analysis of the caspase-3 mRNA expression in MG63 cells treated with matrine for 72 hours

Lane marker: DNA marker;Lane 1:control cells; Lane 2:0.4g/L matrine;Lane 3:0.6g/L matrine;Lane 4:0.8 g/L matrine

3 討 論

目前癌癥已成為嚴(yán)重危害人類生命和健康的常見病、多發(fā)病。癌癥之所以難以治愈是由于癌細(xì)胞不受機(jī)體控制而無限增殖，同時癌細(xì)胞具有侵襲性，能夠破壞鄰近的組織和器官，從而使癌癥難以徹底治愈。苦參堿是從中藥苦參的干燥根中提取的一類活性物質(zhì)，具有明顯的抗炎、抗病毒、抗心律失常等功效[1-2]。近年來其抗腫瘤的作用引起了人們的廣泛關(guān)注[3-4]。本研究將苦參堿作用于 MG63細(xì)胞株，觀察藥物作用后癌細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，觀察癌細(xì)胞受抑制情況以及caspase-3表達(dá)情況，旨在為苦參堿在臨床治療腫瘤過程中提供理論依據(jù)。腫瘤細(xì)胞的顯著特點(diǎn)之一就是生長失控，無限增殖。直接殺死腫瘤細(xì)胞是諸多抗腫瘤藥物的主要作用。本研究結(jié)果顯示，苦參堿作于MG63細(xì)胞后，倒置相差顯微鏡下觀察到，與對照組相比，用藥組的細(xì)胞生長明顯被抑制，胞漿內(nèi)顆粒增多增粗，細(xì)胞貼壁能力減弱，部分細(xì)胞收縮、變圓而懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。

有研究[5-10]發(fā)現(xiàn)苦參堿可呈劑量依賴性的抑制癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，苦參堿能有效抑制MG63細(xì)胞的生長，當(dāng)作用一定時間時，隨著藥物濃度的增加，苦參堿對MG63細(xì)胞的生長抑制率逐漸上升；當(dāng)藥物濃度一定時，適當(dāng)延長作用時間，抑制率也明顯上升。這表明苦參堿對MG63細(xì)胞的抑制作用具有明顯的時間和劑量依賴性。

Caspase-3又稱半胱氨酸蛋白酶32或Yama/Apopain，是caspase家族的重要成員，caspase-3的表達(dá)下調(diào)與惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移和病理分級密切相關(guān)，說明caspase-3在惡性腫瘤表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡失控，進(jìn)而參與惡性腫瘤的發(fā)生與演進(jìn)過程，因此研究caspase-3在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用，以探尋如何在分子水平上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，已日益成為臨床腫瘤康復(fù)治療過程中提高患者生存率和改善患者生活質(zhì)量的全新研究方向。本研究應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)觀察到經(jīng)不同濃度苦參堿處理的MG63細(xì)胞中caspase-3mRNA 表達(dá)不同，其表達(dá)的高低與苦參堿的藥物濃度呈正相關(guān)。表明苦參堿可使caspase-3基因的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，這可能是苦參堿促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一，即通過使caspase-3表達(dá)上調(diào)而實(shí)現(xiàn)。

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