廣藿香酮在大鼠體內的藥動學研究

張若琪，李蕓霞，彭成

·藥理毒理·

廣藿香酮在大鼠體內的藥動學研究

張若琪，李蕓霞，彭成

目的：建立廣藿香酮GC-MS測定方法，并進行藥動學研究。方法：采用Agilent HP-5ms色譜柱（30 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 μm，5 %苯基甲基硅氧烷）；電子碰撞離子源（EI），電子倍增電壓（EMV）模式，檢測離子m/z 168.0。將大鼠分為高、中、低劑量組，分別灌胃給予大鼠廣藿香酮4 mg．kg-1、8 mg．kg-1、16 mg．kg-1，測定不同時間點的血藥濃度，繪制藥時曲線，計算藥動學參數。結果：廣藿香酮高、中、低劑量Cmax分別為48.33±13.07 ng．mL-1、98.83 ±36.14 ng．mL-1、190.52 ±42.78 ng．mL-1、Tmax分別為1.33±0.52 h、1.33 ±0.52 h、1.16 ±0.41 h；t1/2z分別為4.91 ±1.03 h、4.64 ±1.23 h、4.29 ±1.49 h。結論：所用方法處理簡單、靈敏、特異性高、定量準確，可為廣藿香酮的藥動學研究提供方法。大鼠口服廣藿香酮4 mg．kg-1～16 mg．kg-1劑量范圍內，藥動學符合線性動力學過程。

]廣藿香酮; 氣相色譜串聯(lián)質譜法; 血藥濃度；藥動學

廣藿香油有多種藥理活性，包括止吐作用、殺錐蟲活性、抗細菌、抗真菌和Ca2+拮抗活性[1～3]。廣藿香酮是廣藿香的一個重要成分，藥理研究表明，廣藿香酮具有抗細菌和抗真菌[4]的活性。本實驗采用GC-MS法，測定大鼠血漿中廣藿香酮的濃度，并對廣藿香酮灌胃給予大鼠的藥動學進行研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

Agilent 7890A氣相色譜儀，Agilent 5975C串聯(lián)質譜檢測器，Agilent ChemStation軟件（美國Agilent）。廣藿香酮（Pogostone）標準品（自制，純度分別為98 %）；內標（ internal standard, IS）為異土木香內酯標準品（上海一基生物試劑有限公司）；甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純。

1.2 方法與結果

1.2.1 色譜條件 采用Agilent HP-5ms色譜柱（30 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 μm，5 %苯基甲基硅氧烷）；升溫程序為：起始柱溫為110 ℃，保持1 min；以25 ℃．min-1升溫至240 ℃ 并保持1 min；之后以35 ℃．min-1升溫至280 ℃并保持1 min。質譜采用電子碰撞離子源（EI），電子倍增電壓（EMV）模式，增益系數為1.01，實際EMV為1576.47 V。檢測離子為：廣藿香酮m/z 168.0，內標異土木香內酯m/z 190.1。

1.2.2 溶液的制備 分別稱取適量廣藿香酮和內標，用甲醇溶解配制成81.2和503.2 μg．mL-1的對照品貯備液，于4 °C冰箱中冷藏。用甲醇稀釋貯備液，依次配制廣藿香酮工作溶液：2.04、10.06、20.4、100.6、204.0、406.0、812.0 ng．mL-1；內標溶液：5.03 μg．mL-1。

于空白血漿中分別精密加入廣藿香酮工作液和內標溶液，配成廣藿香酮濃度為1.02, 5.03, 10.2, 50.3, 102.0, 203.0, 406.0 ng．mL-1的對照品血漿，內標的血漿濃度為0.503μg．mL-1。

四個濃度的質控樣品(QC)于樣品分析當天配制，廣藿香酮的濃度依次為： 1.02 (LLQC)、5.03(LQC)、50.3 (MQC)、203 (HQC) ng．mL-1。

1.2.3 血漿樣品的處理 于100 μL空白血漿中加入10μL內標溶液，再加入50μL對照品工作液，渦旋30 s后，加2 mL乙酸乙酯，渦旋3 min后于5.0×10 3 rpm離心10 min，取上清液，于30 ℃下氮氣吹干，用100 μL甲醇復溶，于5.0×10 3 rpm離心10 min，取上清液進行GC-MS分析，進樣量為1 μL。

1.2.4 專屬性試驗 取LLQC、LQC、MQC、HQC質控樣本，按“1.2.3”項方法處理后，以“1.2.1”項色譜條件測定廣藿香酮。圖1所示為試驗條件下的廣藿香酮和內標的質譜圖。在試驗條件下，廣藿香酮和內標的保留時間分別為6.1 min和7.4 min（圖2），峰形良好。6份來自不同大鼠空白血漿樣品經“1.2.3”項方法處理后，無明顯干擾。

圖1. 廣藿香酮(A)和內標異土木香內酯(B)的EI-MS質譜圖

圖2 廣藿香酮m/z 168.0 (A) 和內標異土木香內酯m/z 190.1 (B)的GC-MS色譜圖

1.2.5 標準曲線及定量下限 以待測物的峰面積與內標物的峰面積的比值對相應的待測物質量濃度(ng．mL-1) 做標準曲線。結果表明:廣藿香酮血漿濃度的回歸方程為: y=0.0968x-0.1273, r=0.9958，線性范圍為1.02～406 ng．mL-1，最低定量限為1.02 ng．mL-1。

1.2.6 準確度及精密度 按“1.2.3”項方法操作，處理LLQC、LQC、MQC、HQC 4個濃度的:廣藿香酮的QC樣本，每濃度做 6個樣本，連續(xù)測定 3 個分析批，以相應分析批的標準曲線計算混合 QC 樣本中各待測物的濃度。結果表明:廣藿香酮批內、批間的方法回收率分別在98.68-103.92 %和97.17-102.83 %以內，批內、批間精密度RSD均＜8 %(表1) 。

表1 廣藿香酮大鼠血漿樣品的準確度、精密度和萃取回收率

1.2.7 萃取回收率 按“1.2.3”項方法操作，處理血漿樣品中廣藿香酮LQC、MQC、HQC 3個濃度的質控樣品進樣分析后所得待測物的峰面積，與未萃取的樣品進樣分析后所得待測物的峰面積相比，計算萃取回收率。廣藿香酮萃取回收率的平均值為74.3 % ;內標萃取回收率的平均值為 76.3 % ( 表 1) 。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗 取LQC、MQC、HQC 3個濃度的廣藿香酮的QC 樣本，分別考察血漿樣本于室溫下放置 14 h、血漿樣本經處理后在自動進樣器中室溫下放置 12 h、經 3 次凍融及- 20 ℃ 長期冰凍放置 21 d后的穩(wěn)定性。表2顯示，血漿樣本在以上各種貯存條件下均穩(wěn)定。

表2 廣藿香酮大鼠血漿樣品的穩(wěn)定性 (n =3)

1.2.9 藥動學實驗 SD大鼠 (SPF, 雌性)，體重200～220 g，購自成都中醫(yī)藥大學實驗動物中心。試驗前將大鼠適應性喂養(yǎng)3 d，全程不禁飲水。將18只大鼠分為高、中、低劑量組，分別灌胃給予大鼠廣藿香酮4、8、16 mg/kg。于給藥前及給藥后5、15、30、45 min，1、2、4、6、9、12、16和24 h時，經眼眶取血0.3 mL，至于肝素離心管中。于5.0×103 rpm 離心10 min分離血漿，儲存于-20 ℃冰柜中冷藏待測。按“1.2.3”項方法處理后，以“1.2.1”項色譜條件檢測廣藿香酮的濃度。所有數據均用Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight Corporation, USA)軟件處理，計算藥動學參數，結果見表3。采用Newman-Keuls test對三個劑量之間AUC0-t/dose、Cmax/dose和t1/2z進行統(tǒng)計學分析；采用Wilcoxon t rank sum test對三個劑量的Tmax進行統(tǒng)計學分析。結果表明：灌胃給予大鼠廣藿香酮4、8、16 mg．kg-1，Cmax分別為48.33±13.07、98.83 ±36.14、190.52 ±42.78 ng．mL-1；Tmax分別為1.33±0.52、1.33 ±0.52、1.16 ±0.41 h；t1/2z分別為4.91 ±1.03、4.64 ±1.23、4.29 ±1.49 h。經統(tǒng)計學分析，三個劑量下AUC0-t/dose、Cmax/dose、t1/2z和Tmax均無統(tǒng)計學差異，大鼠口服廣藿香酮4-16 mg．kg-1劑量范圍內，藥動學符合線性動力學過程。平均藥-時曲線見圖3。

表3 大鼠灌胃給予廣藿香酮的主要藥動學參數(Mean ±SD , n = 6)

t1/2z, h 4.91 ±1.03 4.64 ±1.23 4.29 ±1.49 Tmax, h 1.33±0.52 1.33 ±0.52 1.16 ±0.41 Vz/F, L 17.19±4.13 15.47 ±3.57 14.56 ±5.45 CLz/F, L/h 2.47±0.53 2.38 ±0.52 2.37 ±0.47 Cmax, ng/mL 48.33±13.07 98.83 ±36.14 190.52 ±42.78

圖3 大鼠灌胃給予廣藿香酮的平均藥-時曲線 (n= 6)

2 討論

本實驗采用GC-MS法測定大鼠血漿中廣藿香酮的濃度，用異土木香內酯作為內標物，方法專屬性高，保留時間合適，峰形良好，血漿樣品處理采用液液萃取法，操作簡單，適用于藥動學的研究。廣藿香酮見光不穩(wěn)定，需避光保存。經統(tǒng)計學分析，高、中、低劑量下AUC0-t/dose、Cmax/dose、t1/2z和Tmax均無統(tǒng)計學差異，大鼠口服廣藿香酮4～16 mg/kg劑量范圍內，藥動學符合線性動力學過程。隨著劑量的增加，Cmax和AUC符合劑量依賴性，其增加的比例與劑量增加的比例一致。廣藿香酮在大鼠體內吸收較快，血藥濃度約1 h達到峰值，說明其具有良好的透膜性。

[1] Y. Yang, K. Kinoshita, K. Koyama, K. Takahashi, T. Tai, Y. Nunoura, K. Watanabe. Anti-emetic principles of Pogostemon cablin (Blanco) Benth [J]. Phytomedicine, 1999, 6:89.

[2] Fumiyuki Kiuchi, Kenji Matsuo, Michiho Ito, Tran Kim Qui, Gisho Honda. New Norditerpenoids with Trypanocidal Activity from Vitex trifolia [J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2004, 52: 1495.

[3] 楊得坡, Chaumont Jean-Pierre, Millet Joeue, 等.藿香和廣藿香揮發(fā)油對皮膚癬菌和條件致病真菌的抑制作用[J]. 中國藥學雜志, 2000, 35(1): 9.

[4] Yi YY, He JJ, Su JQ, Kong SZ, Su JY, Li YC, Huang SH, Li CW, Lai XP and Su ZR. Synthesis and antimicrobial evaluation of pogostone and its analogues [J]. Fitoterapia, 2013, 84:135.

（責任編輯：何瑤）

Pharmacokinetic study of pogostone in rats after oral administration by GC/MS /

ZHANG Ruo-qi, LI Yun-xia, PENGCheng//( Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective: To establish a method for determination of pogostone in rat plasma by GC-MS and to apply it to the study on pharmacokinetics in rats．Method: The chromatographic separation was performed on a capillary column of Agilent HP-5ms, and the spectrometer was operated in electron-impact ionization with an electron multiplier voltage mode. Three dose groups of 4 mg．kg-1, 8 mg．kg-1, 16 mg．kg-1were adopted in the pharmacokinetic experiment. Concentration-time curves were obtained and the pharmacokinetic parameters were calculated. Result: After oral administration of pogostone in three doses, the Cmaxwere 48.33±13.07 ng．mL-1, 98.83 ±36.14 ng．mL-1, 190.52 ±42.78 ng．mL-1. And the Tmaxwere 1.33±0.52 h, 1.33 ±0.52 h, 1.16 ±0.41 h, respectively. Conclusion: The method is successfully applied to a pharmacokinetic study after the oral administration of pogostone to rats. The mean Cmax and AUC0-t values are both linear in the range of doses administered 4 mg．kg-1～16 mg．kg-1to rats.

Pogostone; GC-MS; plasma concentration; pharmacokinetics

R 285.5

A

1674-926X(2014)02-022-03

成都中醫(yī)藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

張若琪（1982-），女，河南偃師人，講師，從事中藥藥動學研究

Tel:13882271228 Email: zrq1007@qq.com

彭成，教授，博士生導師，主要從事疾病動物模型與中藥復方藥理毒理研究和中藥新藥開發(fā)

2013-09-03