白藜蘆醇對病理性瘢痕成纖維細胞及TGF-β1/Smads信號通路的影響

丁繼存，翟曉翔，唐志銘

(1.南京中醫藥大學徐州附屬醫院皮膚科，江蘇 徐州 221003；2.江蘇省徐州市中醫院皮膚科，江蘇 徐州 221003)

病理性瘢痕是一種皮膚纖維化疾病，目前認為成纖維細胞凋亡受阻或過度增殖是其發生的主要病理學基礎。轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) 是參與細胞生長、分化及凋亡的調控因子[1]，Smads蛋白是其下游信號分子，能把TGF-β1介導的信號從細胞外傳遞到細胞核中。研究[2]表明，TGF-β1/Smads信號通路與細胞凋亡的發生有密切的關系。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種多酚類化合物，具多種生物學活性及藥理作用。近幾年來的研究[3-4]結果表明它能通過多種途徑抑制細胞增殖，誘導凋亡，因此起到對抗增生性疾病的作用。本研究觀察Res對病理性瘢痕成纖維細胞增殖、凋亡及TGF-β1/Smads信號通路的影響，旨在為Res應用于臨床治療病理性瘢痕提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：Res(西安冠宇生物技術有限公司)、DMEM培養基及PBS(天津灝洋生物制品科技有限公司)、D-Hank液(北京華邁科生物技術有限責任公司)、0.25%胰蛋白酶-EDTA液(北京Solarbio公司)、胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)、Trizol Reagent ( Invitrogen公司)、兔抗人TGF-β1、Smads單克隆抗體( Santa Cruz公司)、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗兔IgG二抗(BD Pharmingen公司)。

1.1.2 主要儀器：CO2培養箱(日本三洋)、高速離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)、JSM-6510型掃描電鏡(日本電子)、自動酶標儀(美國BioTek儀器有限公司)、電泳儀(北京六一)、PCR 儀 (上海山富科學儀器有限公司)、Quantity-one凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)、熒光顯微鏡及數字CCD成像裝置(日本奧林巴斯)、Image Pro-Plus圖像分析系統(美國Media Cybernetics公司)。

1.1.3 標本來源：實驗標本均來自2011年6月—2012年5月徐州市中醫院皮膚科及燒傷整形科病理性瘢痕手術患者。標本的獲取均征得患者的知情同意，并簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 成纖維細胞分離、培養：無菌條件下切取人病理性瘢痕組織標本，用眼科剪仔細剔除上皮及皮下組織，D-Hank洗3遍，然后剪成1mm3大小的組織塊，置于一無菌瓶中。無菌瓶中加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液5mL，封口，搖勻，4℃冰箱冷消化14h；再置于37℃培養箱中孵育15min，若組織稀疏，邊緣變毛，用200目篩網過濾，收集濾液，其余可以繼續消化；將濾液離心，1 000r/min，7min，棄上清液；用10%FBS的DMEM液5mL混勻沉淀細胞，置于一個25ml的培養瓶中；在37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中靜置培養48h后，用含10%FBS的DMEM換液，鏡下觀察細胞生長情況。細胞接近長滿時，按1∶3比例進行傳代。本實驗選用第5代細胞。

1.2.2 掃描電鏡觀察病理性瘢痕成纖維細胞形態學變化：接種細胞在96孔培養板中分為對照組(A組)和3個藥物濃度組，即B組(濃度10μmol/L)、C組(濃度50μmol/L)、D組(濃度100μmol/L)，濃度篩選根據預實驗中細胞半數抑制濃度1/3～2/3 范圍時的Res濃度得出，每組24個培養孔。用含10%FBS的DMEM液將第5代成纖維細胞配成單個細胞懸液，以1.0×104/mL的密度接種于96孔培養板中，200μL/孔，置于CO2培養箱中常規培養。細胞貼壁后，吸去培養板孔內舊培養液，再每孔加入不含FBS的DMEM液180μL，然后3個實驗組分別加入相應濃度的Res 20μL。對照組則加入含10%FBS的DMEM液20μL。標準環境下孵育24h 后,去除培養液,用溫PBS 沖洗3 次以去除未貼壁細胞,然后用3%戊二醛固定1h后，用PBS洗3次,再用1%四氧化鋨后固定2h,使用不同濃度的乙醇脫水,充分干燥,離子濺射鍍膜儀鍍金,最后在掃描電鏡下觀察細胞的形態變化。

1.2.3 四甲基偶氮唑藍(four methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法檢測病理性瘢痕成纖維細胞增殖狀況：按前述方法分組及接種后，將Res用DMSO溶解為所需濃度，分別加入上述3個藥物濃度組，每孔20μL，對照組每孔加入1%DMSO/DMEM20μL。藥物干預24h，每孔加入5mg/mL MTT(用pH 7.4 PBS配制)20μL，37℃繼續培養4h后，小心吸棄上清，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min，使甲臜結晶顆粒溶解為均勻的藍紫色，以空白孔調零，在酶標儀波長490nm處測定各孔吸光度(OD)值。

1.2.4 反轉錄聚合酶鏈反應檢測TGF-β1，Smad 2、3、4、7 mRNA的表達：細胞培養及干預方法如前。采用Trizol Reagent總RNA提取試劑盒進行總RNA提取，操作步驟按試劑盒說明書進行。電泳鑒定提取RNA的完整性。經測定，所有樣本A260/A280均大于1.8，提示樣本純度較高，無明顯蛋白污染。統一調整總RNA純度為0.5g/L，于-70℃儲存。

取6μL RNA為反轉錄模板。反轉錄反應體系為20μL，反應條件為37℃1h，95℃3min。標準曲線定量法制備cDNA模板標準品，依次10倍梯度稀釋，制備成5個梯度的cDNA模板定量標準品。在GenBank數據庫中獲得目的基因mRNA序列，采用Primer express 2.0軟件，在CDS區設計特異性引物。引物序列見表1。

表1 TGF-β1、Smads基因引物序列及擴增產物片段長度Table 1 TGF-β1,Smads gene primer sequences and amplification fragment length of the product

PCR反應體系為50μL，反應條件，93℃預變性3min，93℃變性30s，57℃退火30s，共循環30次，72℃延伸5min。取6μL PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用Quantity-one凝膠成像分析系統分析各條帶的灰度值，以各目的基因與內參基因β-actin的灰度值比值表示mRNA的相對表達量。

1.2.5 免疫熒光細胞化學染色法檢測TGF-β1，Smad 2、3、4、7蛋白的表達：用上述方法培養病理性瘢痕成纖維細胞24h后，吸去培養液，加入4%多聚甲醛室溫下固定30min，用PBS洗滌3次，0.1%Triton X-100 37℃孵育20min，PBS洗滌，非免疫山羊血清封閉1h，吸凈血清后加入TGF-β1、Smads一抗(1∶100)4℃孵育過夜，次日PBS沖洗后，加入FITC標記的羊抗兔二抗(1∶200)，37℃孵育60min，PBS沖洗，DAPI避光復染，10min后熒光顯微鏡下觀察，用數字電荷耦合元件(charge-couple device,CD)成像裝置采集圖像，Image Pro-Plus圖像分析系統進行圖像分析，測定熒光強度。

2 結 果

2.1 掃描電鏡觀察病理性瘢痕成纖維細胞形態學變化：對照組成纖維細胞鋪展良好，細胞間鑲嵌連接，相鄰細胞的間隙很窄，胞膜完整，表面微絨毛豐富，卷曲成叢狀，規則排列(圖1A，1B)。用10μmol/L Res處理病理性瘢痕成纖維細胞48h后，細胞間隙增寬，細胞明顯回縮，鋪展面積減小(圖2A)，細胞表面的微絨毛逐漸消失(圖2B),膜表面可見出泡現象(圖2C)，最后胞體固縮,細胞裂解成許多胞膜完整、大小不一的凋亡小體狀結構(圖2D)。在50μmol/L和100μmol/L Res作用下，細胞的變化與上述情況相似。

2.2 MTT法檢測病理性瘢痕成纖維細胞增生狀況：以不同濃度的Res處理病理性瘢痕成纖維細胞后，采用MIT法檢測其增殖情況，結果顯示，各不同藥物濃度組與對照組相比，OD值均明顯偏低，差異有統計學意義(P<0.05)。說明Res對病理性瘢痕成纖維細胞的增殖有顯著抑制作用，并且這種抑制作用有劑量依賴性。見表2。

GroupsConcentrationsOD valueA-0.485±0.034 B10μmol/L0.324±0.017?C50μmol/L0.267±0.014? D100μmol/L0.173±0.009?

*P<0.05vsgroup A byqtest

2.3 RT-PCR檢測各組TGF-β1、Smads mRNA的表達：提取的總RNA經紫外線分光光度儀測定其濃度及純度，RNA 的A260/A280值為1.8～2.0，表明純度良好。RNA變性瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3。圖中各電泳條帶顯示，28S和18S區帶清晰集中，表明未被降解，RNA完整性好。

病理性瘢痕成纖維細胞經10、50、100μmol/L的Res干預后，其TGF-β1，Smad 2、3、4 mRNA的相對表達量降低，而Smad 7 mRNA 的相對表達量增加，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4及表3。Pearson相關性分析表明，TGF-β1，Smad 2、3、4 mRNA的相對表達量與Res干預濃度呈負相關(r=-0.869，P=0.02；r=-0.749，P=0.03；r=-0.751，P=0.03；r=-0.695，P=0.04)，Smad 7 mRNA的相對表達量與Res干預濃度呈正相關(r=0.882,P=0.02)。

GroupsTGF-β1Smad 2Smad 3Smad 4Smad 7A1.54±0.121.71±0.141.62±0.131.47±0.080.68±0.04B1.49±0.15?1.66±0.11?1.55±0.08?1.40±0.15?0.82±0.03?C1.38±0.17?1.48±0.09?1.44±0.16?1.32±0.10?1.17±0.07?D1.14±0.07?1.23±0.08?1.31±0.07?1.12±0.08?1.23±0.10?

*P<0.05vsgroup A byqtest

2.4 免疫熒光檢測各組TGF-β1、Smads蛋白表達：Res各濃度組TGF-β1，Smad 2、3、4 熒光強度隨著Res的干預濃度升高而降低，呈負相關(r=-0.921，P=0.02；r=-0.913，P=0.02；r=-0.843，P=0.03；r=-0.865，P=0.03)，而Smad 7熒光強度隨著Res的干預濃度升高而增強，呈正相關(r=0.854,P=0.03)，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

GroupsTGF-β1Smad 2Smad 3Smad 4Smad 7A36.23±3.2828.97±3.1134.35±2.9631.16±3.6523.09±2.78B32.43±2.54?25.32±3.17?30.45±2.84?28.32±3.06?29.11±3.19?C27.13±3.19?21.14±2.88?26.95±3.12?25.18±3.23?35.52±3.62?D21.47±2.77?17.37±3.04?21.86±2.42?20.37±2.95?38.83±3.51?

*P<0.05vsgroup A byqtest

3 討 論

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，以真皮成纖維細胞增殖并產生過量的胞外基質(Ⅰ、Ⅲ型膠原，黏蛋白和黏多糖等)為特點[5],是一種皮膚結締組織增生性疾病。本病常發生在燒傷、外科手術及外傷后，不僅影響美觀，甚至可以引起嚴重的功能障礙。目前病理性瘢痕的治療方法較多，但因其發病機制仍不清楚，故治療沒有取得突破性進展[6]。因此，通過更深入的揭示病理性瘢痕的發病機制，并尋找一種新的有效的防治病理性瘢痕的天然藥物是皮膚外科領域的一項重要課題。

Res是一種含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，是植物在受到真菌感染、紫外線照射或病理狀況下產生的植物防御素。它具有廣泛的生物學活性和多種藥理作用，如抗腫瘤、抑制血小板聚集、抗炎、免疫調節、抗菌抗病毒[7]。此外，它能通過多種途徑抑制細胞增殖，誘導其凋亡，因此起到對抗增生性疾病的作用。但Res是否能夠抑制病理性瘢痕成纖維細胞增殖，并誘導其凋亡，目前鮮有報道。

病理性瘢痕發生的主要病理學基礎是成纖維細胞凋亡不足或受阻，導致其增殖相對過度。TGF-β1參與細胞生長、分化及凋亡，是目前公認的與病理性瘢痕形成密切相關的最重要的細胞因子之一。Smads蛋白是TGF-β1的下游信號分子，能把TGF-β1介導的信號從細胞外傳遞到細胞核中。Smads家族蛋白根據其結構和功能不同可分為3類[8]：受體調節型Smad(Smad 1、2、3、5、8)、共同型Smad(Smad 4)、抑制型Smad(Smad 6、7)。研究[9]表明，TGF-β1/Smads信號通路與細胞凋亡的發生有密切的關系。在細胞凋亡過程中，TGF-β1首先與細胞膜上的受體結合，進而磷酸化胞質內的受體調節型Smads,即Smad 2、3，磷酸化的Smad 2、3再與Smad 4形成異三聚體，轉運到核內，與核內的轉錄因子共同作用或獨立調控下游特異基因的表達。

有研究[10]表明miR-200c可通過降低磷酸化Smad 2和Smad 3的蛋白表達水平來抑制經TGF-β1誘導的人瘢痕疙瘩纖維細胞的增殖和膠原合成，因此TGF-β1/Smads信號通路與病理性瘢痕的發生、發展密切相關。Res是否能通過調控TGF-β1/Smads信號通路來對病理性瘢痕成纖維細胞的增值、凋亡產生影響，目前國內外文獻還沒有這方面的研究報道。因此，本課題組對此進行了一些探索。

研究應用掃描電鏡對Res干預后的病理性瘢痕成纖維細胞進行觀察，在形態學上可見典型的凋亡特征。MTT法檢測結果顯示，不同濃度Res干預后，病理性瘢痕成纖維細胞的增殖都受到一定程度的抑制，其抑制作用隨著Res濃度增加而增強，表明這種抑制作用有一定的劑量依賴。RT-PCR及免疫熒光檢測結果顯示，病理性瘢痕成纖維細胞經不同濃度的Res干預后，其TGF-β1，Smad 2、3、4 mRNA和蛋白表達降低，而Smad 7 mRNA和蛋白表達增加，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。Pearson相關性分析表明，TGF-β1，Smad 2、3、4 mRNA和蛋白表達與Res干預濃度呈負相關，而Smad 7 mRNA和蛋白表達與Res干預濃度呈正相關。由此可知，Res能夠抑制病理性瘢痕成纖維細胞的增值，誘導其凋亡，其機制可能與下調TGF-β1，Smad 2、3、4表達并上調Smad 7表達有關，這為后續開發利用Res治療病理性瘢痕提供了理論依據。

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