甘草酸二胺對腹膜透析大鼠腹膜功能的影響

衛志鋒，李 多，陸繼芳，劉圣君，李素敏

(1.河北北方學院附屬第一醫院腎內科，河北 張家口 075000；2.河北北方學院附屬第一醫院消化內科，河北 張家口 075000；3.河北醫科大學第二醫院腎內科，河北 石家莊 050000)

全世界目前擁有大約13萬腎臟病患者接受腹膜透析治療，但有近50%的患者在開始治療后的5年內停止腹膜透析治療，其中腹膜纖維化引起的腹膜超濾衰竭是腹膜透析患者退出腹膜透析的主要原因。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在腹膜結構和功能的改變中起著非常重要的作用，有研究[1]報道VEGF的上調參與了腹膜毛細血管的重塑。本研究探討甘草酸二胺對腹膜透析大鼠腹膜功能的影響，并檢測血液及透析液中VEGF的濃度，了解其是否與大鼠腹膜功能相關，旨在為今后的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物：選用雄性SD大鼠50只，體質量150～200g，由河北北方學院動物室提供。飼養條件，一籠5只，每天光照12h，室溫保持24℃、相對濕度45%，大鼠的飲食及飲水在整個實驗過程中不受限制。

1.2 藥品及試劑：4.25%腹膜透析液(廣州百特醫療用品有限公司)；己酮可可堿(武漢海特生物制藥股份有限公司)；甘草酸二胺(石家莊制藥集團華盛制藥有限公司)；脂多糖(上海研生生化試劑有限公司)；大鼠VEGF ELISA試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)。

1.3 分組與給藥：50只雄性SD大鼠，隨機分為5組，即正常對照組、生理鹽水組、模型組、己酮可可堿治療組、甘草酸二胺治療組，每組10只。空白對照組，不進行任何處理；生理鹽水組，每日腹腔內注射0.9%氯化鈉注射液20mL；模型組，每日腹腔內注射4.25%腹膜透析液20mL并于第1、3、5、8、10、12、16、19、23、26天腹腔注射脂多糖(0.6mg/kg)。己酮可可堿治療組，每日腹腔內注射4.25%腹膜透析液20mL并于第1、3、5、8、10、12、16、19、23、26天腹腔注射脂多糖(0.6mg/kg)+己酮可可堿6mg/kg。甘草酸二胺治療組，每日腹腔內注射4.25%腹膜透析液20mL并于第1、3、5、8、10、12、16、19、23、26天腹腔注射脂多糖(0.6mg/kg)+甘草酸二胺10mg/kg。實驗過程中未發現4.25%腹膜透析液對實驗大鼠有不良反應。

1.4 標本收集和觀察指標：腹膜功能檢查，實驗進行30d后行2h腹膜平衡試驗，10%水合氯醛麻醉大鼠，4.25%腹膜透析液25mL腹腔注射，留取0、4h腹膜透析液及血液標本，注射4h后沿著腹白線處剪開腹膜，留取腹腔內液體，準確測量。血液標本用5 000r/min的速度離心10min，腹透液標本用1 500r/min的速度離心5min，留取腹膜透析液上清液、血清和血漿。超濾量=(最后出水量-25)mL,采用終點法測定透析液尿素濃度(Durea),血漿尿素濃度(Purea),初始腹膜透析液葡萄糖濃度(D0),2h透析液葡萄糖濃度(D4),計Durea/Purea和D4/D0。留取血液及腹膜透析液用ELISA法觀察VEGF濃度。各項數值為10只動物的平均值。應用全自動血液分析儀檢測透出液的白細胞數量，同時進行白細胞計數及分類，超過1 000/mm3的大鼠,為發生腹膜炎,退出本次實驗(模型組中發現2只大鼠出現腹膜炎，并退出實驗)。

1.5 檢測方法：將腹膜透析液標本離心機中選1 500r/min速度離心10min，血液標本選取3 000r/min速度離心15min。每孔加入標準品0.1mL，標準品為用樣品稀釋液等倍稀釋成不同濃度的液體，37℃條件下反應90min，移去液體，不洗。加入用抗體稀釋液稀釋的生物素抗大鼠轉化生長因子β1抗體，每孔0.1mL(1∶100)，37℃條件反應60min，0.01mol/L PBS洗滌，加入稀釋液稀釋的親和素-過氧化物酶復合物，每孔0.1mL(1∶100)，37℃條件反應30min，0.01mol/L PBS洗滌,每孔加入TMB顯色液0.1mL，反應15min，每孔加入TMB終止液0.1mL。用酶標儀在450nm測定OD值，零孔設為對照值，據各孔OD值計算待測VEGF的濃度。

2 結 果

2.1 腹膜功能的改變：模型組超濾量及D4/D0較空白對照組和生理鹽水組明顯降低，Durea/Purea明顯升高(P<0.05)；己酮可可堿治療組和甘草酸治療組超濾量和D4/D0較模型組明顯升高，Durea/Purea明顯降低(P<0.05)。兩治療組以上指標差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1各組腹膜功能比較

組別只數超濾量(mL)Durea/PureaD4/D0空白對照組104.6±2.30.52±0.070.56±0.05生理鹽水組104.7±2.30.53±0.060.57±0.05模型組8-6.4±2.2?#0.88±0.11?#0.39±0.04?#己酮可可堿治療組10-2.7±2.0?#△0.67±0.09?#△0.48±0.02?#△甘草酸二胺治療組10-2.6±2.0?#△0.66±0.09?#△0.45±0.03?#△

*P<0.05與空白對照組比較 #P<0.05與生理鹽水組比較 △P<0.05與模型組比較(q檢驗)

2.2 ELISA法測定血清及腹透液中的VEGF表達：血清中的VEGF水平各組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；腹透液中空白對照組和生理鹽水組比較差異無統計學意義(P>0.05)；模型組、己酮可可堿治療組、甘草酸二胺治療組透析液中VEGF的水平較空白對照組、生理鹽水組升高，差異有統計學意義(P<0.05)，且己酮可可堿治療組、甘草酸二胺治療組較模型組降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

組別只數VEGF血清腹膜透液 空白對照組10232.91±40.8733.31±9.33生理鹽水組10238.91±35.4032.31±6.09模型組8256.91±45.77132.45±23.67?#己酮可可堿治療組10247.77±34.3468.21±9.55?#△甘草酸二胺治療組10250.11±32.7870.34±8.94?#△

*P<0.05與空白對照組比較 #P<0.05與生理鹽水組比較 △P<0.05與模型組比較(q檢驗)

VEGF：vascular endothelial growth factor

3 討 論

腹膜透析與血液透析相比，腹膜透析能更好地保護殘余腎功能，并能更好地保護心血管系統穩定性，臨床上常由于各種原因使腹膜透析患者退出腹膜透析治療，如腹膜透析液的生物不相容性、長期腹透引起透析相關性腹膜炎以及終末期腎臟病患者存在全身微炎癥狀態等導致腹膜纖維化[1]。炎癥包括由感染引起的急、慢性腹膜炎和終末期腎病患者的全身微炎癥狀態，兩者結合是腹膜纖維化的主要原因，最終導致超濾衰竭。新生血管增多是腹膜纖維化重要的病理機制之一，在超濾衰竭的發病機制中處于主導地位[2]。腹膜透析治療6年以上高達89%患者出現血管病變[3]。Yoko等[3]使用一種抗血管形成藥TNP-470,通過抑制實驗大鼠血管及纖維母細胞的增生從而延緩大鼠腹膜纖維化。進一步說明新生血管的形成在腹膜纖維化中起一定的作用。

己酮可可堿臨床上主要用于周圍血管疾病的治療，目前已有研究證實己酮可可堿有抗纖維化作用[4]，其能改善腹膜纖維化大鼠的腹膜透析效果。本研究利用己酮可可堿為藥物對照，觀察甘草酸二胺在腹膜纖維化中的作用。甘草酸二胺是中藥甘草有效成分的第3代提取物，具有較強的抗炎、保護細胞膜的作用，該藥在化學結構上與醛固酮的類固醇環相似，可阻礙可的松與醛固酮的滅活，從而發揮類固醇樣作用。王磊[5]研究表明甘草酸二胺對特發性肺間質纖維化有顯著的保護作用。

VEGF作為血管形成和致腹膜纖維化的主要因子，在腹膜新生血管形成和纖維化的過程中發揮各自的生物學作用，影響腹膜超濾[6-7]。Kyuden等[8]實驗證明高糖能使人腹膜纖維化加重，應用VEGF拮抗劑后腹膜纖維化減輕。有研究[9-10]表明可通過下調VEGF的表達，改善糖尿病腎病時腎小球毛細血管的通透性，緩解基膜增厚，減輕細胞外基質的沉積，延緩糖尿病腎病的發展。本研究結果顯示，血清中VEGF水平各組間差異無統計學意義(P>0.05)；腹透液中空白對照組和生理鹽水組比較差異無統計學意義(P>0.05)，模型組與空白對照組和生理鹽水組比較，VEGF明顯升高(P<0.05)，己酮可可堿治療組和甘草酸二胺治療組較模型組VEGF明顯降低(P<0.05)。表明己酮可可堿是治療腹膜纖維化比較成功的藥物，而甘草酸二胺與己酮可可堿比較，具有與其相當的療效。VEGF水平在腹膜透析過程中升高，說明可能在腹膜纖維化過程中發揮作用，而且甘草酸二胺和己酮可可堿的干預作用可以減輕腹膜纖維化程度，其機制可能是通過降低VEGF水平來實現的。

[1] SAXENA R.Pathogenesis and treatment of peritoneal membrane failure[J].Pediatr Nephrol,2008,23(5):695-703.

[2] 趙占正,劉章鎖,李艷,等.內皮抑素在大鼠腹膜的表達及其與腹膜血管新生的關系[J].中華腎臟病雜志,2009,25(6):437-440.

[3] YOKO Y,MASANOBU M,KATSUSHIGE A,et al.TNP-470,an angiogenesis inhib-itor,suppresses the progression of peritoneal fibrosis in mouse experimental model[J].Kidney International,2004,66(6):1677-1685.

[4] 龔燕梅,曾紅兵,李鵬飛,等.己酮可可堿對腹膜功能的影響及其機制研究[J].醫藥導報,2008,27(11):1298-1301.

[5] 王磊.甘草酸二胺對特發性肺間質纖維化血清透明質酸及Ⅲ型前原的影響[J].實用心腦肺血管病雜志,2012,20(4):641-643.

[6] 袁江姿,方煒,倪兆慧,等.血管生成素Ⅱ與腹膜透析時腹膜血管新生的關系[J].中華腎臟病雜志,2009,25(6):415-419．

[7] 高丹,劉章鎖,趙占正,等.血管內皮生長因子和內皮抑素在人腹膜組織的表達及其與腹膜毛細血管新生的關系[J].中華腎臟病雜志,2010,26(2):105-109.

[8] KYUDEN Y,ITO T,MASAKI T,et al.Tgf-beta1 induced by high glucose is controlled by angiotensin-converting enzyme inhibitor and angiotensin Ⅱ receptor blocker on cultured human peritoneal mesothelial cells[J].Perit Dial Int，2005，25 (5):483-491.

[9] 趙占正,曹穎,劉章鎖,等.重組人內皮抑素對尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜新生血管形成的影響[J].中華腎臟病雜志,2010,26(10):791-795.

[10] 杜飛，高原，張文輝，等.燈盞花素對腹膜透析相關腹膜間皮細胞 VEGF及TGF-β1的影響[J].山西中醫,2012,28(9):40-42.