血小板添加液體外保存血小板質(zhì)量的研究

劉立坤，李永乾

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院輸血科，河北 石家莊 050051)

血小板的標(biāo)準(zhǔn)保存方法是20～24℃恒溫振蕩保存，此條件下血小板制品易受污染，保存期僅為5d[1]，難以滿足臨床大量需求。應(yīng)用添加液低溫保存血小板已引起廣泛關(guān)注，研制適用于低溫冷藏血小板的保存液非常有意義。我們采用含海藻糖的添加液替代65%血漿10℃冷藏單采血小板保存7d，并對(duì)血小板有關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器：血小板添加液成分，海藻糖75.00g/L、Na2HPO43.05g/L、KCl 0.37g/L、NaH2PO4·2H2O 1.05g/L、NaCl 4.05g/L、MgCl2·6H2O 0.30 g/L、Na3枸櫞酸·2H2O 3.18g/L[2]；血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(日本Sysmex公司)；血小板聚集分析儀(美國(guó)Chronolog公司)；血?dú)夥治鰞x(法國(guó)Nova公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)；CL-8000型全自動(dòng)生化分析儀(日本島津)。

1.2 血小板的制備及保存：取20份單采血小板，將其分為2組，實(shí)驗(yàn)組離心(1 000g，10min)，保留35%血漿，加入65%的血小板添加液混勻，10℃冷藏靜置保存，對(duì)照組用100%血漿維持在(22±2)℃常溫保存，于1、5、7d分別取樣測(cè)定2組pH、血小板計(jì)數(shù)(plateled count,PLT)、低滲休克反應(yīng)(hxpotonic shock response,HSR)、血小板形變能力(extent of shape change,ESC)、血小板P選擇素(cluster of differentiation 62 platelet,CD62p)、葡萄糖(glucose,GLU)平均消耗量和乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)平均釋放量等指標(biāo)。

1.3 血小板制品質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的檢測(cè)：用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定PLT；用血?dú)夥治鰞x測(cè)定pH；采用血小板聚集分析儀法測(cè)定ESC和HSR[3]；以IgG1PE為陰性對(duì)照，CD62pPE標(biāo)記后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD62p表達(dá)率[4]；采用酶顯色法測(cè)定LDH，采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定GLU。

2 結(jié) 果

2.1 2組體外保存血小板質(zhì)量的比較：隨著時(shí)間延長(zhǎng)，2組pH值均呈逐漸下降趨勢(shì)，但實(shí)驗(yàn)組pH較高，2組組間、不同時(shí)點(diǎn)間以及組間·時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；2組PLT指標(biāo)比較平穩(wěn)，在組間、不同時(shí)點(diǎn)間以及組間·時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HSR、ESC隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，CD62p隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，但2組間HSR、ESC和CD62p只在不同時(shí)點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，組間和組間· 時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

組別pH1d5d7dPLT(×1011/L)1d5d7dHSR(%)1d5d7d實(shí)驗(yàn)組7.30±0.037.22±0.057.10±0.0712.6±1.512.1±1.312.5±1.373.5±8.065.2±8.361.7±5.2對(duì)照組7.26±0.047.04±0.076.80±0.0912.4±1.412.1±1.412.4±1.273.0±8.066.3±8.363.0±5.6組間F=196.811 P=0.000F=0.027 P=0.871F=0.306 P=0.584時(shí)點(diǎn)間F=345.368 P=0.000F=1.545 P=0.220F=56.718 P=0.000組間·時(shí)點(diǎn)間F=53.769 P=0.000F=0.016 P=0.984F=0.486 P=0.617組別ESC(%)1d5d7dCD62p(%)1d5d7d實(shí)驗(yàn)組16.5±3.87.6±1.35.4±0.628.9±10.139.9±10.944.3±11.0對(duì)照組16.8±4.07.4±1.15.3±0.829.1±10.240.6±11.245.6±11.6組間F=0.008 P=0.931F=0.084 P=0.774時(shí)點(diǎn)間F=330.135 P=0.000F=109.546 P=0.000組間·時(shí)點(diǎn)間F=0.150 P=0.861F=0.021 P=0.979

PLT：platelet；HSR：hxpotonic shock response；ESC：extent of shape change；CD26p：cluster of differentiation 62 platelet

2.2 2組GLU消耗量和LDH釋放量比較：1～7d試驗(yàn)組GLU平均消耗量及LDH平均釋放量均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 2組保存期間GLU消耗量和LDH釋放量比較

組別GLU平均消耗量LDH平均釋放量實(shí)驗(yàn)組0.08±0.030.15±0.03對(duì)照組0.12±0.020.25±0.04t4.9618.944P0.0000.000

GLU：glucose；LDH：lactic dehydrogenase

3 討 論

血小板對(duì)溫度變化極為敏感，4℃保存的血小板輸注體內(nèi)后會(huì)很快被清除，止血功能遠(yuǎn)低于20～24℃保存的血小板[5]。當(dāng)溫度低于20℃血小板就會(huì)從正常的鐵餅狀變成圓球狀，并發(fā)生聚集而被激活。目前標(biāo)準(zhǔn)的血小板保存條件是在20～24℃振蕩保存，存放有效期僅為5d。如何增加血小板存活率及延長(zhǎng)其保存期，減少血小板活化，已成為目前研究的熱點(diǎn)。應(yīng)用添加液保存血小板不僅可以減少輸血反應(yīng)的發(fā)生率，還可以節(jié)約大量的血漿資源，血小板添加液能很好地維持血小板的功能。海藻糖分子比較小，能夠填充到生物蛋白質(zhì)大分子的空隙中，使生物蛋白質(zhì)大分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化受到限制，能抑制寒冷導(dǎo)致的血小板變形聚集[6]；海藻糖性質(zhì)穩(wěn)定、不易降解，在體內(nèi)的分解產(chǎn)物是兩分子的葡萄糖，對(duì)機(jī)體無(wú)毒副作用，是一種非常有研究潛力的低溫血小板保護(hù)劑[7]。本研究是在血小板保存添加液Ⅲ的基礎(chǔ)上添加海藻糖配制成血小板添加液，并以血小板添加液替代65%自體血漿保存單采血小板。

血小板的止血功能主要取決于血小板形態(tài)、活化水平、代謝情況等，反映血小板膜是否完整的重要指標(biāo)主要有血小板HSR[8]；血小板形態(tài)常用ESC來(lái)評(píng)價(jià)[9]；pH與血小板的損傷相關(guān)密切；CD62p是存在于血小板α顆粒膜上的蛋白質(zhì)分子，血小板激活后CD62p能與血小板質(zhì)膜融合表達(dá)于血小板膜的表面，是血小板活化的較重要標(biāo)志[9]，CD62p的變化與血小板活化程度具有相關(guān)性[4]。在本研究中，2組pH值在組間、不同時(shí)點(diǎn)間以及組間·時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明血小板在保存期間實(shí)驗(yàn)組的保存環(huán)境優(yōu)于對(duì)照組；隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，2組HSR、ESC逐漸下降，CD62p表達(dá)率明顯升高，2組間HSR、ESC、CD62p只在不同時(shí)點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，組間和組間· 時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明添加海藻糖的血小板添加液在較低溫度(10℃)時(shí)對(duì)血小板起到了很好的保護(hù)作用；2組PLT指標(biāo)比較平穩(wěn)，在組間、不同時(shí)點(diǎn)間以及組間·時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，進(jìn)一步證明了以上觀點(diǎn)。10℃條件細(xì)胞代謝功能較20℃降低，血小板的GLU消耗量明顯低于常溫，LDH主要存在于細(xì)胞內(nèi)部，當(dāng)細(xì)胞受到損傷破壞后才會(huì)釋放出來(lái)，本研究顯示LDH在實(shí)驗(yàn)組的釋放量低于對(duì)照組，證明血小板添加液保存的血小板完整性較血漿對(duì)照組好。以上結(jié)果均提示血小板保存在以血小板添加液替代65%自體血漿的混合液中與100%血漿中的效果相當(dāng)。

總之，在10℃液態(tài)狀態(tài)下，使用血小板添加液部分替代血漿保存單采血小板可使血小板的功能得到良好的保護(hù)，既延長(zhǎng)了血小板的保存期限，又降低了血小板制品受污染的概率。雖然現(xiàn)階段使用血小板添加液保存單采血小板的相關(guān)資料還比較少，但本研究數(shù)據(jù)提示，采用血小板添加液10℃低溫保存單采血小板效果與傳統(tǒng)的常溫血漿保存方法相當(dāng)，本研究將為血小板保存技術(shù)的發(fā)展提供一定的依據(jù)。

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