瑞士乳桿菌生長動力學(xué)模型的建立與評價

林巧

（西昌學(xué)院，四川西昌615000）

瑞士乳桿菌生長動力學(xué)模型的建立與評價

林巧

（西昌學(xué)院，四川西昌615000）

采用修正的Gompertz方程和平方根模型建立了不同溫度條件下瑞士乳桿菌生長的動力學(xué)模型，分別在20、28、36、44℃液態(tài)培養(yǎng)條件下，測定不同培養(yǎng)期內(nèi)的菌數(shù)。結(jié)果表明：利用Matlab工具擬合不同溫度下的生長情況，Gompertz模型能較好地描述瑞士乳桿菌在不同溫度下的生長動態(tài)，平方根模型能很好地呈現(xiàn)溫度對最大比生長速率的影響關(guān)系，通過在30℃和40℃溫度下培養(yǎng)得到的瑞士乳桿菌生長實驗值來驗證瑞士乳桿菌生長動力學(xué)模型的可靠性，結(jié)果表明模型與試驗數(shù)據(jù)能夠很好的擬合。由此所建立的次級模型可以有效預(yù)測在20℃～44℃條件下瑞士乳桿菌的生長情況。

瑞士乳桿菌；Gompertz方程；平方根模型

微生物建模的實驗數(shù)據(jù)一般采用液體培養(yǎng)基進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，但是食品本身具有其復(fù)雜性，液體培養(yǎng)基相對較為單一，能否真正代替食物進(jìn)行實驗仍然是爭論的話題。不過有研究人員做了對比實驗[1-2]用培養(yǎng)基建立模型，把得到的預(yù)測值與文獻(xiàn)中微生物的生長情況進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多情況下不會出現(xiàn)大的差異。因此，在多數(shù)情況下，可以在實驗室通過培養(yǎng)基來獲取大量的實驗建模數(shù)據(jù)，并同時做好相應(yīng)的對比實驗，用真正的食品得到相應(yīng)數(shù)據(jù)對模型進(jìn)行驗證。

本動力學(xué)模型與試驗數(shù)據(jù)是否能夠很好的擬合，證明了整個工藝過程中瑞士乳桿菌能否最大限度的滿足其自然生長代謝變化規(guī)律。從而有助于系統(tǒng)有效地控制瑞士乳桿菌工業(yè)擴大培養(yǎng)過程。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

菌株：瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）：由西昌學(xué)院輕化工程學(xué)院生物實驗室保存。

1.1.2 儀器

采樣板、手術(shù)刀、手術(shù)剪、磨口廣口瓶、酒精燈、磨口三角瓶、燒杯、三角燒瓶、培養(yǎng)皿、移液管、試管、膠頭吸管、接種環(huán)、玻棒、量筒、脫脂棉、紗布等。

1.1.3 設(shè)備

MJ-250B-Ⅱ微機霉菌培養(yǎng)箱，西安唯信機電設(shè)備有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺，上虞市道墟杰達(dá)儀器廠；全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；不繡鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器，北京中諾遠(yuǎn)東科技有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

MRS肉湯：按照GB 4789.35—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗、乳酸菌檢驗進(jìn)行配置。

1.2 方法

1.2.1 菌種計數(shù)

計數(shù)參照GB/T4789.2—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗、菌落總數(shù)測定》。

1.2.2 瑞士乳桿菌的培養(yǎng)

選取20、28、36、44℃為實驗溫度，按1.2.1操作程序進(jìn)行試驗。每隔8 h，從生長培養(yǎng)基中取1mL培養(yǎng)液作系列梯度稀釋，取合適的稀釋度，每個稀釋度做3個平行實驗，用平板計數(shù)法于37℃條件下培養(yǎng)24 h后測瑞士乳桿菌數(shù)，對有效的菌落數(shù)取平均數(shù)，此數(shù)據(jù)即為該溫度下特定培養(yǎng)時間的菌數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用Matlab 7.0統(tǒng)計分析軟件（Statsoft），采用軟件中的非線性最小二乘法（Levenberg-marquardt），選取適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)模型進(jìn)行回歸擬合。

1.4 數(shù)學(xué)模型的建立

1.4.1 瑞士乳桿菌生長動力學(xué)模型（初級模型）

將20、28、36、44℃培養(yǎng)條件下得到的瑞士乳桿菌實驗數(shù)據(jù)，分別用修正的Gompertz方程[3]描述不同溫度下的生長動態(tài)。修正的Gompertz方程如式（1）所示。

1.4.2 溫度對瑞士乳桿菌生長影響的動力學(xué)模型（二級模型）

溫度對瑞士乳桿菌生長影響的動力學(xué)模型用平方根（Belehradck）方程描述，是Ratkow sky等[4]根據(jù)微生物在0～40℃溫度條件下，最大比生長速率（μmax）和延滯時間（Lag）倒數(shù)的平方根與溫度之間存在線性關(guān)系，提出的一個簡單的經(jīng)驗?zāi)Ｐ汀７匠淌饺缦拢?/p>

式中：T是培養(yǎng)溫度，℃；Tmin是一個假設(shè)的概念，指微生物沒有代謝活動時的溫度，℃，即在此溫度下最大比生長速率為零；b是方程的常數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1 不同溫度下瑞士乳桿菌在培養(yǎng)基上的生長參數(shù)

表1 瑞士乳桿菌在20、28、36、44℃培養(yǎng)條件下的生長參數(shù)表（cfu/m L）Tab le1 Lactobacillus helveticus in 20，28，36，44℃culture conditions on the growth parameters table（cfu/m L）

由表1可知，溫度對瑞士乳桿菌的生長有明顯的影響，且各溫度下，時間與生物量的關(guān)系是隨著時間的延長微生物的量也在加，當(dāng)時間為32 h時，微生物的總量最大。過了32 h微生物的總量就逐漸下降。這是因為隨著時間的延長微生物逐漸增多消耗了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，使其不能滿足大量微生物的生長、繁殖的需要；而且微生物在代謝過程中也會釋放出一些代謝物，這些代謝物也可能反過來對微生物本身的成長起抑制作用，從而導(dǎo)致微生物的總量下降。在不同溫度下，同一時間段微生物的生長情況也不相同。其變化是隨著溫度的升高，微生物含量呈先上升在下降的趨勢。其中在36℃下，瑞士乳桿菌生長情況最佳。這是由于生長代謝以及繁殖都是酶參加的。根據(jù)酶促反應(yīng)的動力學(xué)[5]來看，溫度升高，反應(yīng)速度加快，呼吸強度增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長繁殖加快。但隨著溫度的上升，酶失活的速度也越大，降低代謝速率，使微生物的總量不高。

2.2 瑞士乳桿菌生長動力學(xué)模型

根據(jù)修正的Gompertz方程回歸得到瑞士乳桿菌在不同溫度下的生長動力學(xué)模型：

1.1 研究對象 先證者出生時臨床表現(xiàn)為頭發(fā)根部發(fā)白，發(fā)梢淡黃；3個月時整根頭發(fā)白中帶淡黃色，眉毛白色，睫毛白色，眼球水平震顫。父母否認(rèn)雙方家族存在其他患者，父母本人表型均正常，非近親婚配，否認(rèn)孕期存在用藥史或不良環(huán)境接觸史。本研究經(jīng)廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有基因診斷工作均取得患者家屬的同意并簽署知情同意書。

當(dāng)試驗溫度為20℃時：

所以，

由上式，同理可得：

結(jié)果表明，修正Gompertz方程能較好地預(yù)測本實驗中瑞士乳桿菌生長的S型曲線，在4種溫度下所得到的回歸相關(guān)系數(shù)值均較高，R2分別為0.937 8、0.944 3、0.986 2、0.966 5，表明上述方程的擬合性很好。

2.3 瑞士乳桿菌生長動力學(xué)參數(shù)

表2是瑞士乳桿菌在不同溫度下的生長動力學(xué)參數(shù)，利用修正Gompertz方程求得瑞士乳桿菌動力學(xué)參數(shù)的R2在0.937 8到0.986 2之間，表明不同溫度下瑞士乳桿菌的生長動力學(xué)模型擬合度較好，能準(zhǔn)確可靠地預(yù)測MRS肉湯中瑞士乳桿菌的生長狀態(tài)。利用Gompertz方程由表1所建立模型可求得瑞士乳桿菌的生長動力學(xué)參數(shù)，20、28、36、44℃延滯時間分別為1.238、0.934、0.638、0.584 h，最大比生長速率分別為0.041 4、0.067 9、0.097 5、0.121 7 h-1。

表2 瑞士乳桿菌的Gompertz模型參數(shù)表Table2 Characteristic param etersof the Gompertz model developed for lactobacillus helveticus

2.4 二級模型的擬合

由上述分析可知，應(yīng)用修正Gompertz方程能很好地預(yù)測在20、28、36、44℃溫度條件下瑞士乳桿菌的生長，但卻無法描述溫度的變化對瑞士乳桿菌生長的影響。在實際中微生物的培養(yǎng)過程中，溫度會在一定范圍內(nèi)波動。溫度對微生物生長動力學(xué)的影響一般用平方根模型來進(jìn)行描述[6-9]。

圖1 溫度與延滯時間（Lag）的關(guān)系Fig.1 Temperature and delay time（Lag）relationship

圖2溫度與最大比生長速率（μmax）的關(guān)系Fig.2 The tem perature and them aximum specific grow th rate（μmax）relationship

圖1 、圖2分別是應(yīng)用平方根模型描述的溫度與延滯時間（Lag）及最大比生長速率（μmax）之間的關(guān)系。由圖1可以看出，溫度與Lag、μmax間均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，兩種模型的R2分別為0.958 7和0.991。溫度與Lag、μmax間的Belehradck方程為：

表3 溫度與延滯時間（Lag）及最大比生長速率（μmax）平方根模型的殘差值Table3 Temperature and delay time（Lag）and the maximum specific growth rate（μmax）square root model residual value

表3是根據(jù)溫度與Lag及μmax平方根模型得到的實測值和預(yù)測值，從中可以看出，它們的殘差絕對值均小于0.1，說明上述模型描述的溫度與Lag和μmax的關(guān)系是完全可信的。

2.5 瑞士乳桿菌生長動力學(xué)模型的驗證和評價

為了評價瑞士乳桿菌生長動力學(xué)模型的可靠性，圖3、圖4將在30℃和40℃溫度下擴大培養(yǎng)得到的瑞士乳桿菌生長實驗值，用修正Gompertz方程得到的生長曲線與瑞士乳桿菌生長動力學(xué)預(yù)測模型得到的預(yù)測生長曲線進(jìn)行了比較。可以發(fā)現(xiàn)，無論對于30℃還是40℃，模型都能較好地預(yù)測出瑞士乳桿菌的生長動態(tài)，預(yù)測值的上下波動幅度較小。表4在30、40℃溫度下瑞士乳桿菌的生長動力學(xué)參數(shù)Nmax、Lag和μmax的實驗值與利用平方根模型求得的預(yù)測值進(jìn)行了比較。由表4可見，在30、40℃條件下瑞士乳桿菌數(shù)及其生長動力學(xué)參數(shù)的預(yù)測值與實測值均吻合良好。

圖3 在30℃條件下預(yù)測和實測的瑞士乳桿菌的生長曲線Fig.3 Under the condition of 30℃predicted and measured lactobacillus helveticus growth curve

圖4 在40℃條件下預(yù)測和實測的瑞士乳桿菌的生長曲線Fig.4 Under the condition of40℃predicted and measured lactobacillus helveticus growth curve

表4 在30、40℃貯藏中瑞士乳桿菌生長動力學(xué)參數(shù)的預(yù)測值與實測值Table4 In 30,40 degrees in the storage of lactobacillus helveticus growth kinetics parameters of the predicted and measured values

3結(jié)論

本試驗旨在為瑞士乳桿菌建立生長動力學(xué)模型，為以后瑞士乳桿菌的工業(yè)擴大化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)，因此本文只建立了一級與二級模型。而微生物生長動力學(xué)模型很多文獻(xiàn)[12-15]報道，大多數(shù)文獻(xiàn)都選用了修正的Gompertz模型作為初級模型，并聯(lián)用平方根方程來描述不同溫度下瑞士乳桿菌的生長動態(tài)。選用修正的Gompertz模型，聯(lián)用平方根方程可獲得一些重要數(shù)據(jù)，如最大比生長速率（μmax）、遲滯期（Lag）及所需溫度下的菌數(shù)，這也是多數(shù)研究選用該模型的原因。

對于初級模型，采用修正的Gompertz模型來擬合不同溫度下瑞士乳桿菌的生長情況，可以發(fā)現(xiàn)，在20℃～44℃條件下模型的回歸相關(guān)系數(shù)R2都在0.9以上，模型極顯著，表明該方程可以很好地描述不同溫度下瑞士乳桿菌的生長動態(tài)。對于次級模型，用平方根模型來描述溫度與Lag、μmax之間的關(guān)系，從而可以計算得到二級模型如下式：=0.0071（T+8.662），其中T的取值范圍為2℃～53℃[15]。其判定系數(shù)R2分別為0.958 7和0.991，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

最后，通過在30℃和40℃溫度下培養(yǎng)得到的瑞士乳桿菌生長實驗值來驗證瑞士乳桿菌生長模型的可靠性，研究發(fā)現(xiàn)所建立的模型對于瑞士乳桿菌生長動態(tài)的模擬比較準(zhǔn)確。在20℃～44℃范圍內(nèi)溫度與Lag和μmax呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，R2值分別為0.958 7和0.991，模型的殘差值的絕對值均小于0.1，在0上下浮動，表明該模型描述的溫度與Lag和μmax的關(guān)系是完全可信的。

[1]何國慶,丁立孝.食品微生物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2009：165-166

[2]GIBSON A M,BRATCHELLN,ROBERTST A.Predicting microbial growth：growth responses of salmonellae in a laboratory medium as affected by pH,sodium chloride and storage temperature[J].Int J Food Microbiol,1988,6(2)：155-178

[3]WIJTZEST,MCCLURE P J,ZWIETERINGM H,et al.Modelling bacterial growth of Listeria monocytogenes as a function of water activity,pH and temperature[J].Int JFood Microbiol,1993,18(2)：139-149

[4]ZWIETERING M H,JONGERBERGER I,ROMBOUTSFM,etal. Modeling of the bacterial growth curve[J].Application Environment Micribiology,1990,6(6)：1875-1881

[5]王鏡巖.生物化學(xué)[M]。北京：高等教育出版社,2007年.245-246

[6]LEBERTI,ROBLES-OLVERAV,LEBERTA.Application of polyno-mial models to predict growth of mixed cultures of Pseudomonas spp.and Listeria in meat[J].International Journal of Food Microbiology,2000,61：27-39.

[7]BARANYI J,ROBERTS T A.A dynamic approach to predictingbac-terial growth in food[J].International Journal of Food Microbiology,1994,23：277-294

[8]BUCHANANR L,WHITINGRC,DAMERTW C.When is simple good enough：a comparison of the gompertz,baranyi,and three phaselinear models for fitting bacterial growth curves[J].Food Microbiology,997,14：313-326

[9]GILLC,DUSSAULTR,HOLLEY R A,etal.Evaluation of the hygienic performances of the processes for cleaning,dressing and cooling of pig carcasses in eight packing plants[J].International Journal of Food Microbiology,2000,58：65-72

[10]Baranyi J．Roberts TA.A terminology for models in predictive microbiology—A reply to K.R.Davey.Food Mirobiology.1992,9：355

[11]Whiting RC,Buchanan R L．A classification of models for predictive microbiology．Food Microbiology,1993,10：175-177

[12]李苗云,朱應(yīng)舉,趙改名.微生物預(yù)測模型研究及其在肉品工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品科技,2008(2)：58-61

[13]吳偉偉,張曉東,周光宏.冷卻豬肉中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌生長動力學(xué)模型的建立與評價[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報,2007(5)：96-99

[14]王宇光,徐暉,王克明．共固定化雙菌種發(fā)酵海藻酒動力學(xué)的研究[J]．浙江科技學(xué)院學(xué)報,2003(1)：5-8

[15]李苗云,張秋會,趙改名.冷卻豬肉中單增李斯特氏菌生長動力學(xué)模型的建立與評價[J].食品科技,2009(30)：234-236

[16]王欽德,楊堅.食品試驗設(shè)計與分析[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版,200：38-40

The Establishment and Evaluation of Lactobacillus Helveticus Grow th Kinetics Model

LINQiao
（Xichang college，Xichang 615000，Sichuan，China）

In this exprimenr，the dynamic model of the growth of Lactobacillus helveticus under different temperature conditions using the modified Gompertz equation and the square root model，under the20，28，36，44℃liquid culture conditions，determined the number of bacteria at different culture period.The results showed that: using Matlab tools fit different temperatures of growth，Gompertz model can betterdescribe thegrowth dynamicsof Lactobacillus helveticus atdifferent temperatures，square root model showing the relationship of temperature on the maximum specific growth rate，verifing the reliability of Lactobacillus helveticus growth kinetics model by temperature at30℃and 40℃culture of Lactobacillus growth experimental values，results showed that the model with the experimental data can be a good fit.Thus the establishment of sub-model can effectively predict the growth in the20℃～44℃under the conditions of Lactobacillus helveticus.

Lactobacillus helveticus；Gompertz equation；Square root model

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.15.012

2013-07-18

林巧（1978—），女（漢），副教師，碩士，研究方向：食品安全檢測。