自然反義轉(zhuǎn)錄物L(fēng)mo4as對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)重要編碼基因Lmo4的調(diào)節(jié)作用

張 靖，吳 朝，朱麗媛，陰 彬，侯 琳，彭小忠，2*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.神經(jīng)科學(xué)中心，北京100005)

長非編碼RNA 是指長度大于200 nt、不具有蛋白編碼功能的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。近年轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)不同的物種中都有大量的長非編碼RNA，其在表觀遺傳、疾病發(fā)生、個(gè)體發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)等多個(gè)生命過程具有重要的調(diào)節(jié)作用［1］。自然反義轉(zhuǎn)錄物(nature antisense transcript，NAT)是長非編碼RNA 中的一類，因由蛋白編碼基因的互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄而得名［2］。這種雙向轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象最早于1976年在病毒中發(fā)現(xiàn)，隨后在不同物種中均有發(fā)現(xiàn)［3］。NAT 在轉(zhuǎn)錄組中的比例隨著物種的進(jìn)化而升高，提示它們在進(jìn)化中可能具有重要功能［3］。已有研究結(jié)果表明，一些自然反義轉(zhuǎn)錄物和正義轉(zhuǎn)錄物形成互補(bǔ)雙鏈，通過遮蔽、降解或增加其穩(wěn)定性等多種方式影響正義轉(zhuǎn)錄物的生成和穩(wěn)定性［4-5］。

神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育是個(gè)體發(fā)育中最為復(fù)雜的過程，轉(zhuǎn)錄因子在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［6］。前期研究表明，在大腦皮層發(fā)育過程中部分重要的轉(zhuǎn)錄因子存在NAT［7］。Lmo4 是一個(gè)擁有兩個(gè)LIM 結(jié)構(gòu)域(Zinc－ binding domain present in Lin-11，Isl-1，Mec-3，LIM domain)的連接蛋白，在小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中具有重要作用［8］。其基因敲除小鼠有致死表型，并出現(xiàn)腦部發(fā)育不全、神經(jīng)管不能閉合等缺陷［9］。目前尚無Lmo4 的自然反義轉(zhuǎn)錄物(Lmo4as)的相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)ICR 品系孕鼠與E12.5、E14.5、E16.5和E18.5 的胎鼠，以及P1 和P7 的幼鼠［孕鼠購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(京)2006-0008;于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心培養(yǎng)］。

1.2 材料

Taq DNA 聚合酶、DNA 凝膠回收純化試劑盒和質(zhì)粒DNA 提取試劑盒［北京天根(TIANGEN)公司］;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4 DNA 連接酶、DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、RNase 抑制劑和RNase-Free DNaseI(TaKa-Ra 公司)。

1.3 細(xì)胞與組織RNA 的提取及RT-qPCR

對(duì)于貼壁生長的細(xì)胞，先用PBS 洗細(xì)胞1 ～2次，然后按照每(5 ～10)× 106個(gè)細(xì)胞:1 mL Trizol的比例直接將其加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中;取新鮮鼠腦組織在液氮中研磨，制成1 mg 組織:1 mL Trizol 的比例，氯仿-異丙醇抽提，75%乙醇漂洗后，空氣干燥，加入適量DEPC 處理過的水溶解。使用DNA 酶Ⅰ對(duì)RNA 進(jìn)行處理。每消化10－3mg RNA 用1 U 的DNA 酶Ⅰ，37 ℃處理0.5 h，然后用異丙醇沉淀過夜，純化RNA 樣品。用等量的cDNA 作為模板，用GAPDH 為內(nèi)參。

1.4 cDNA 末端快速擴(kuò)增(3'RACE 和5'RACE)

使用Invitrogen 公司的3'RACE 及5'RACE 試劑盒(#18373-019、#18374-058)進(jìn)行，具體實(shí)驗(yàn)步驟詳見試劑盒說明書。RACE 后巢式PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化連入T 載體測序，獲得轉(zhuǎn)錄本3'RACE 及5'RACE 序列。

3'RACE 引物:GSP1:5'-CTTTGTCATGGGCGGA GC-3';GSP2:5'-GCGGAGCAACATCAGGACAAG-3';GSP3:5'-ATTAGCTTCATTAGTCATTTCCCTCC-3';GSP4:5'-GAGGGTAGAAAGCAGATTGGTGATG-3'; GSP5:5'-CCATCTCCCATTAGCCCAGGTTC-3'。5'RACE 引物:GSP1:5'-GAACCTGGGCTAATGG-3';GSP2:5'-CATCACCAATCTGCTTTCTACCCTC-3';GSP3:5'-AT GAGTTAAAAGGAAAGAGATGTGGC-3' 。

1.5 組織原位雜交

探針制備:將包含有目的轉(zhuǎn)錄本探針序列的pGEM-3zf 質(zhì)粒酶切線性化后，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄(T7 轉(zhuǎn)錄酶)。制備小鼠胚胎腦各時(shí)期的組織切片(厚度18 ～22 μm)，經(jīng)50 ℃烘片30 min、焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的4%多聚甲醛溶液中固定20 min、1 ×焦碳酸二乙酯處理的PBS 洗片后覆蓋雜交液，雜交盒中預(yù)雜交1 h。85 ℃5 min 變性探針，替換預(yù)雜交液為含探針的雜交液(0.1 ～0.2 ng/μL)，65 ～70 ℃雜交過夜(12 ～16 h)。預(yù)熱0.2 ×SSC，65 ℃洗片;轉(zhuǎn)移至緩沖液B1，室溫洗2 次;緩沖液B2 室溫封閉1 h;入緩沖液B2 +地高辛抗體(anti-DIG-Ab;1 ∶5 000)，4 ℃過夜。緩沖液B1 中洗片(3 × 20 min)，緩沖液B3 平衡;200 μL 緩沖液B4顯色。ddH2O 停止反應(yīng)，入100%甲醇中處理15 min～30 min 后封片，觀察。

1.6 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

雙熒光素酶的測定采用Promega 公司的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，具體操作參見試劑盒說明書。載體質(zhì)粒為經(jīng)過改造的pcDNA3.1，使用XhoⅠ和XbaⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，插入Lmo4-3'UTR。構(gòu)建Lmo4as 過表達(dá)質(zhì)粒，同時(shí)準(zhǔn)備以下材料:1)TK 質(zhì)粒(海參熒光質(zhì)粒)，作為共轉(zhuǎn)染的內(nèi)參。2)miRNA 的過表達(dá)質(zhì)粒，質(zhì)粒的濃度約500 ng/μL。構(gòu)建Lmo4-3'UTR-luciferase 使用引物:Lmo4-3UTR-Up 5'-CCCTCGAGTTGGGAATAGCGGTGCTTGC-3';Lmo4-3UTR-Down 5'-GCTCTAGACAACATCAGGACAAGAA CAC-3';產(chǎn)物長度820 bp。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Lmo4as 的全長序列擴(kuò)增及驗(yàn)證

經(jīng)3'RACE 及5'RACE 實(shí)驗(yàn)，初步確定Lmo4as的全長1 226 bp，含29 個(gè)A 的poly-A 尾，并克隆獲得其全長轉(zhuǎn)錄本(圖1A)。使用UCSC 數(shù)據(jù)庫(mm9)比對(duì)結(jié)果如圖1B 所示，結(jié)合3'RACE 結(jié)果證明了Lmo4as 具有多聚腺苷酸尾(圖1B)。其全長序列信息如圖1C 所示。

圖1 Lmo4as 的全長序列擴(kuò)增Fig 1 The full length of Lmo4as

2.2 Lmo4as 與Lmo4 mRNA 在小鼠大腦發(fā)育階段的表達(dá)情況

E14.5 的原位雜交結(jié)果顯示，Lmo4as 與Lmo4 的mRNA 在空間分布上有所不同，NAT 的信號(hào)相對(duì)比較彌散，呈廣泛分布(圖2A 箭頭所示)。Lmo4 的mRNA主要分布于端腦腹側(cè)和局部外側(cè)皮層，而Lmo4as 以室周區(qū)較高。多個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的胎鼠全腦實(shí)時(shí)定量PCR 檢測結(jié)果顯示二者表達(dá)水平隨時(shí)間變化的特征(圖2B)。

2.3 Lmo4as 與miR-124 負(fù)性調(diào)節(jié)Lmo4 mRNA

本研究首先利用Target scan 軟件(http://www．targetscan．org/)預(yù)測到Lmo4 轉(zhuǎn)錄本的3'UTR 區(qū)域可能是mmu-miR-124 的靶序列，且在多種物種中極其保守(圖3A)。進(jìn)而克隆Lmo4 轉(zhuǎn)錄本的3'UTR，并檢測miR-124 mimics、miR-124-inhibitor 及Lmo4as 對(duì)含有Lmo4 的3'UTR 螢光素酶報(bào)告基因活性的影響。結(jié)果顯示，miR-124 mimics 可導(dǎo)致螢光素酶活性下降3 倍左右(P＜0.01);而miR-124 的inhibitor 可使該螢光素酶的活性升高至1.5 倍(P＜0.05);過表達(dá)Lmo4as 后，螢光素酶活性下降約3 倍(P＜0.05)(圖3B)。

圖2 Lmo4 mRNA 及NAT 的時(shí)空表達(dá)特征分析Fig 2 The spatio-temporal analysis of Lmo4as in the developing embryonic brain of mice

圖3 miR-124 和Lmo4as 對(duì)Lmo4 的mRNA 進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)Fig 3 Lmo4as negatively regulates Lmo4 at the post-transcriptional level，similar function with miR-124

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育依賴于在特定時(shí)空條件下的復(fù)雜基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)對(duì)于細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)換和譜系的形成都具有重要的作用。越來越多的證據(jù)表明長非編碼RNA 可參編碼基因的表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，且具有時(shí)空特異性。近期使用艾倫腦圖(Allen Brain Atlas)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行的研究表明，在總數(shù)為1 328 的長非編碼RNA 中，有849 個(gè)表達(dá)在成年小鼠大腦中，大部分(623 個(gè))選擇性地表達(dá)于特定腦區(qū)、細(xì)胞類型或者亞型中［10］。本研究原位雜交結(jié)果也提示Lmo4as可能在發(fā)育的一定時(shí)空發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控功能。

根據(jù)原位雜交和實(shí)時(shí)定量PCR，可觀察到Lmo4as 與Lmo4 mRNA 在時(shí)空表達(dá)上有一定的關(guān)聯(lián)，提示二者之間可能存在調(diào)控關(guān)系。進(jìn)而通過熒光素酶報(bào)告基因離體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Lmo4as 對(duì)Lmo4 mRNA 具有順式的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。近期一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)AS1DHRS4 可以通過順/反式的作用沉默編碼基因DHRS4［11］，從而提示NAT 不僅可以直接結(jié)合正義轉(zhuǎn)錄物來發(fā)揮作用，還可以通過其他間接方式來實(shí)現(xiàn)對(duì)正義轉(zhuǎn)錄物的調(diào)控，因此具有更復(fù)雜的分子機(jī)制，所以Lmo4as 是否還有反式調(diào)節(jié)的功能還需要進(jìn)一步的研究探討。

除了轉(zhuǎn)錄因子與長非編碼RNA 的關(guān)系以外，RNA 其他成員的存在讓這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)變得更加復(fù)雜。長非編碼RNA 和miRNAs 之間可以產(chǎn)生拮抗作用，例如在阿爾茲海默病中，主要的致病因素是淀粉樣肽Aβ，淀粉樣前體蛋白(APP)在β 淀粉樣前體蛋白裂解酶(BACE1)和r-分泌酶的連續(xù)作用下切產(chǎn)生Aβ。BACE-AS 通過增強(qiáng)BACE-1 的穩(wěn)定性上調(diào)BACE-1 的表達(dá)水平，之后又證明了miR-485-5p 參與到對(duì)BACE-1 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，在神經(jīng)系統(tǒng)中miR-485-5p 與BACE-AS 形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)BACE-1蛋白的表達(dá)水平［4-5］。在生物體內(nèi)某些長非編碼RNA 可以形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物ciRS-7 含有大量的miR-7 的結(jié)合位點(diǎn)，可以競爭性的結(jié)合miR-7，從而發(fā)揮調(diào)控作用［5］。通過體外的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，可觀察到miR-124 和Lmo4as 都具有通過作用于3'UTR 從而抑制性調(diào)節(jié)Lmo4，但這種類似的抑制性調(diào)節(jié)功能在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中如何發(fā)揮功能，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。

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