不同時期花粉癥患者外周血淋巴細胞亞群的數量變化及其臨床意義

刁 穎，孫勁旅，湯 蕊，顧建青，李 摯

(中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院變態反應科，北京100730)

花粉癥屬Ⅰ型變態反應，特應性患者因接觸變應原花粉而引起過敏性鼻炎、哮喘等癥狀，其過敏癥狀的發作與花粉的播散季節相吻合，具有明顯的季節性和地域性。在中國北方地區，蒿屬花粉是夏秋季最重要的氣傳花粉之一，這種花粉引起的花粉癥是中國最常見的過敏性疾病。目前花粉癥的研究主要集中在流行性調查、花粉致敏蛋白、食物交叉過敏和中醫治療等方面［1-5］，而對花粉癥患者不同時期，即花粉季節的發作期和非花粉季節的非發作期之間的免疫機制研究不多，特別是兩期患者體內免疫細胞的變化。本研究用自身對照方式，檢測2013年8 ～12月北京協和醫院變態反應科門診診治的花粉癥患者發作期和非發作期外周血淋巴細胞亞群含量，以期進一步探討體內免疫細胞在蒿屬過敏花粉癥患者發作期和非發作期的功能狀態和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2013年8 ～9月份，秋季花粉癥患者癥狀發作期，在北京協和醫院變態反應科門診就診的33 例花粉癥患者;非花粉季節(11 ～12月份)作為非發作期，對33 例患者進行召回隨訪，其中20 人成功回訪，均無任何癥狀，也未使用藥物治療，男性11 例，女性9 例，平均年齡為(34.5 ±8.6)歲(25 ～62 歲)。其中14 人為單純過敏性鼻炎，6 人為過敏性鼻炎合并哮喘。本次研究經北京協和醫院倫理委員會審核通過，所有入組對象均簽署知情同意書。

入組花粉癥患者均符合以下條件:

1)至少有2年由蒿為主要致敏花粉引起過敏性鼻炎有/無季節性哮喘的病史;2)對蒿的皮內試驗呈陽性反應，至少為+ +;3)蒿血清sIgE ＞3 級，可合并其他花粉過敏，塵螨、真菌血清sIgE 為0 級;4)采血前至少停用抗組胺藥物3d 和類固醇激素1個月;5)未患有上下呼吸道感染和其他器質性疾病。

1.2 主要試劑

溶血素，Multitest 6-color TBNK Kit，單克隆抗體APC-Cy7-CD3、PerCP-CD4、PE-Cy7-CD8、PE-CD28、APC-CD38 及同型對照抗體(BD 公司)。

1.3 方法

用真空采血管分別抽取花粉癥患者發作期與非發作期的EDTA 抗凝靜脈全血4 mL，2 mL 用于外周血細胞計數，采用全自動血液分析儀(XS-800i，上海希森美康醫用電子有限公司)檢測;2 mL 用于外周血淋巴細胞亞群分析，采用北京協和醫院感染科臨床診斷實驗室流式細胞儀(FACS CantoⅡ，BD 公司)檢測。每管加入全血100 μL、CD3、CD4、CD8、CD28 和CD38 單克隆抗體各10 μL 進行標記，避光孵育15 min，加入500 μL 溶血素，避光溶血15 min，加入2 mL PBS，1 500 r/min，離心5 min，棄上清，重復1 次，加入750 μL PBS 混勻上機檢測，同時設同型陰性對照。T 細胞、B 細胞和NK 細胞檢測參照TBNK 試劑盒說明書進行。

1.4 統計學分析

采用SPSS17.0 軟件進行統計，所測數值用均數±標準差(±s)表示。配對資料要求進行正態性方差齊性檢驗，滿足正態方差齊時，發作期與非發作期比較采用配對t 檢驗，不滿足正態方差齊時采用配對Wilcoxon 秩和檢驗。

2 結果

2.1 花粉癥患者外周血細胞計數比較

花粉癥患者發作期與非發作期外周血細胞計數結果(表1)顯示，花粉癥發作期外周血嗜酸性細胞和嗜堿性細胞明顯高于非發作期(P＜0.01)，發作期嗜酸性細胞與蒿血清sIgE(39.02 ±36.73)呈正相關關系(P＜0.01)。

2.2 花粉癥患者外周血淋巴細胞亞群分析

花粉癥患者發作期與非發作期外周血淋巴細胞亞群結果(表2，圖1)顯示，花粉癥患者外周血NK 細胞計數非發作期高于發作期(P＜0.05)。CD4+CD28+T 細胞和CD8+CD28+T 細胞計數發作期高于非發作期，特別是CD8+CD28+在兩期之間比較有顯著性差異(P＜0.05)。CD8+CD38+T 細胞計數發作期顯著高于非發作期(P＜0.05)。

表1 花粉癥患者外周血細胞計數Table 1 The peripheral bloodcounts of thehayfever patients(±s，109/L，n=20)

表1 花粉癥患者外周血細胞計數Table 1 The peripheral bloodcounts of thehayfever patients(±s，109/L，n=20)

＊P＜0.01 compared with non-onset group．

groupleukocytelymphocytemonocyteneutrop hilbasophileosinophil non-onset6.62 ±1.492.22 ±0.610.44 ±0.173.7 1 ±1.240.03 ±0.020.18 ±0.10 onset7.28 ±1.692.23 ±0.560.43 ±0.124.11 ±1.360.05 ±0.02*0.46 ±0.21*

表2 花粉癥患者外周血淋巴細胞亞群絕對計數Table 2 The lymphocyte subsets counts of peripheral blood in hay fever patients(±s，cells/μL，n=20)

表2 花粉癥患者外周血淋巴細胞亞群絕對計數Table 2 The lymphocyte subsets counts of peripheral blood in hay fever patients(±s，cells/μL，n=20)

*P＜0.05 compared with non-onset group．

groupB cellNK cellCD3 +T CD3 +CD4 +T CD3 +CD8 +T CD4+CD28+T CD8 +CD28 +T CD8 +CD38 +T CD4/CD8 non-onset 298 ±144 282 ±143 1 627 ±464 652 ±269441 ±143629 ±274250 ±91173 ±631.60 ±0.70 onset308 ±118 221 ±114* 1 694 ±470 696 ±253489 ±188671 ±256304 ±136*233 ±95*1.55 ±0.58

圖1 采用流式細胞術對花粉癥患者外周血淋巴細胞亞群分析Fig 1 Flowcytometric analysis of peripheral blood lymphocyte subsets in hay fever patients

3 討論

花粉癥由患者接觸致敏花粉引起，主要表現為鼻部和/或呼吸道癥狀，以肥大細胞和嗜堿性細胞表面IgE 高親和力受體(FcεRI)與IgE 抗體結合，激活釋放炎性介質，引起嗜酸性細胞浸潤為特點。嗜酸性細胞是過敏性炎性反應的主要效應細胞，現已知IL5 對嗜酸性細胞有分化、聚集和激活作用，阻斷IL5 可明顯降低過敏患者外周血嗜酸性細胞含量［6］。嗜堿性細胞不僅作為過敏炎性反應效應細胞，還有始動炎性反應和抗原提呈作用［7-8］，并參與IgG 介導的嚴重過敏反應［9］。本研究中花粉癥患者發作期外周血嗜酸性和嗜堿性細胞顯著升高，嗜酸性細胞與sIgE 呈正相關，提示外周血嗜酸性和嗜堿性細胞可作為過敏性疾病輔助指標，發作期外周血嗜酸性細胞和嗜堿性細胞濃度升高，可能致使局部病變如鼻黏膜的嗜酸性和嗜堿性細胞含量增高。

淋巴細胞是機體免疫系統功能最重要的細胞群，根據其生物功能和細胞表面抗原的表達可分成3 大類，以CD3+為標志的T 淋巴細胞(T 淋巴細胞分為CD4+T 細胞和CD8+T 細胞)、B 淋巴細胞和NK 細胞。CD4+T 細胞主要為Th 細胞亞群，Th1/Th2 失衡與過敏性炎性反應密切相關［10］。CD8+T細胞具有免疫抑制和維持機體內環境穩定性的功能。比較分析花粉癥不同發作時期CD3+T、CD4+T、CD8+T 淋巴細胞和CD4/CD8 的表達，結果顯示發作期和非發作期表達均處于同一水平，均在正常參考范圍內，提示花粉癥雖然是一種與機體免疫變化相關的疾病，但與免疫功能密切的淋巴細胞的變化仍在機體可調節范圍內，并不像系統性紅斑狼瘡(SLE)等導致免疫系統產生嚴重的不可逆變化，另一方面由于本研究患者主要為過敏性鼻炎，可能主要表現在局部鼻黏膜的免疫細胞改變，而與外周血淋巴細胞變化無關，導致淋巴細胞無顯著變化，但在臨床評價機體免疫狀態時多檢測外周血淋巴細胞亞群。NK 細胞是機體重要的免疫細胞，通過分泌不同的細胞因子參與過敏炎性反應，NK 細胞現已分為多種亞群，包括與Th1 細胞相似的NK1 和與Th2 細胞相似的NK2，NK1 和NK2 細胞失衡與過敏性疾病有關［11］。本研究顯示非發作期NK 細胞高于發作期，可能表明花粉癥患者非發作期外周血中NK 細胞多為NK1 亞群。

CD28 分子是T 淋巴細胞的協同刺激信號受體，CD38 是存在于許多免疫細胞表面的糖蛋白，通過對激活信號的傳導，促進T 細胞的增殖和激活，可作為細胞活化標志［12-14］。本研究顯示發作期CD8+CD28+和CD8+CD38+T 細胞升高，提示發作期花粉癥患者部分免疫細胞處于激活狀態，由此推測如果抑制發作期免疫細胞的激活狀態，可能會有效減輕患者的過敏癥狀，本研究能夠為過敏性疾病的此類治療提供理論基礎。

志謝:感謝北京協和醫院感染科李太生主任對實驗的指導和實驗室邱志峰、謝靜老師在技術上的支持。

［1］Nakae K，Baba K．Update on epidemiology of pollinosis in Japan:changes over the last 10 years［J］．Clin Exp Allergy Rev，2010，10:2-7．

［2］Caimmi D，Raschetti R，Pons P，et al．Epidemiology of cypress pollen allergy in Montpellier［J］．J Investig Allergol Clin Immunol，2012，22:280-285．

［3］Niggemann B，Schmitz R，Schlaud M．The high prevalence of peanut sensitizationin childhood is due to cross-reactivity to pollen［J］．Allergy，2011，66:980-981．

［4］楊汝斌，劉玲．花粉變應原研究現狀［J］．醫學綜述，2010，16:327-329．

［5］Brinkhaus B，Hummelsberger J，Kohnen R，et al．Acupuncture and Chinese herbal medicine in the treatmentof patients with seasonal allergic rhinitis:a randomized-controlled clinical trial［J］．Allergy，2004，59:953-960．

［6］Stone KD，Prussin C，Metcalfe DD．IgE，mast cells，basophils，and eosinophils［J］．J Allergy Clin Immunol，2010，125:73-80．

［7］Obata K，Mukai K，Tsujimura Y，et al．Basophils are essential initiators of a novel type of chronic allergic inflammation［J］．Blood，2007，110:913-920．

［8］Sokol CL，Chu NQ，Yu S，et al．Basophils function as antigen-presenting cells for an allergen-induced T helper type 2 response［J］．Nat Immunol，2009，10:713-720．

［9］Mukai K，Obata K，Tsujimura Y，et al．New insights into the roles for basophils in acute and chronic allergy［J］．Allergol Int，2009，58:11-19．

［10］Wambre E，James EA，Kwok WW．Characterization of CD4+T cell subsets in allergy［J］．Curr Opin Immunol，2012，24:700-706．

［11］von Bubnoff D，Andrès E，Hentges F，et al．Natural killer cells in atopic and autoimmune diseases of the skin［J］．J Allergy Clin Immunol，2010，125:60-68．

［12］Cao W，Qiu ZF，Li TS．Parallel decline of CD8+CD38+lymphocytes and viremia in treated hepatitis B patients［J］．World J Gastroenterol，2011，17:2191-2198．

［13］Serrano VS，Gutiérrez C，Vallejo A，et al．The CD4/CD8 ratio in HIV-infected subjects is independently associated with T-cell activation despite long-term viral suppression［J］．J Infect，2013，66:57-66．

［14］閻雙緩，陳翠英，曹治宸，等．慢性HBV 感染者T 細胞亞群與CD28 亞群的變化［J］．臨床肝膽病雜志，2009，25:327-330．