利用RIP-Chip篩選結合多聚胞嘧啶結合蛋白2的microRNAs

韓 為，林細華，陰 彬，彭小忠

(中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和醫學院基礎學院生物化學與分子生物學系醫學分子生物學國家重點實驗室，北京100005)

多聚胞嘧啶結合蛋白2(PCBP2)是對多聚胞嘧啶［Poly(C)］具有高度親和性的RNA 結合蛋白，在胞核和胞質中穿梭表達［1］。通過對核心識別位點“ACCC”和“CCCU”的特異性結合［2］，PCBP2 參與到靶mRNA的穩定性，選擇性剪接和翻譯調節［3］。近年來，有研究人員注意到microRNA(miRNA)也可以直接結合PCBP2 蛋白，通過“誘騙”機制干擾PCBP2 對靶mRNA的調控作用［4］。PCBP2 還可以與Dicer 酶相互作用，調節miRNA 生成［5］。本實驗室在前期工作中發現PCBP2 在人神經膠質瘤細胞中高表達。本研究通過核糖核蛋白免疫沉淀-芯片技術(RIP-Chip)在人正常神經膠質細胞(HA)和神經膠質瘤細胞(T98G 和U87MG)中篩選與(PCBP2)相互作用的miRNA。

1 材料與方法

1.1 材料

HA 細胞和AM 培養基(ScienCell 公司)，T98G和U87MG 細胞(美國模式培養物集存庫ATCC)，MEM/EBSS 和胎牛血清(Gibco 公司)，β-actin 抗體(Sigma 公司)，正常兔IgG、兔抗人PCBP2 抗體和RIP-Assay Kit for microRNA(MBL 公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自(北京中杉金橋生物技術有限公司)，ECL Western blot 發光檢測試劑、蛋白酶抑制劑、糖原和Protein A Agarose 瓊脂糖(Roche 公司)，RNA 酶抑制劑和DTT［寶生物工程(大連)有限公司］。

1.2 細胞培養

人正常星形膠質細胞HA 培養于含2%胎牛血清的AM 培養基中，人神經膠質瘤細胞T98G 和U87MG 培養于含10%胎牛血清的MEM 培養基中。所有細胞置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，按1∶2細胞每2 ～3 d 傳代1 次。

1.3 Western blot 檢測

收集3 種細胞系或這3 種細胞的RIP 蛋白樣品，98 ℃ 10 min 變性后－ 20 ℃保存。樣品經10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離約2 h 后，半干轉法轉移至硝酸纖維素膜上，5%高蛋白脫脂奶粉封閉30 min。按相應比例封閉一抗，室溫搖床孵育3 h，TBST 漂洗10 min ×3 次，與辣根過氧化物酶標記的二抗室溫搖床孵育1.5 h，TBST 漂洗10 min ×3次，ECL 顯色。

1.4 RIP 實驗

收集2×107個細胞，應用MBL 公司的RIP-Assay Kit for microRNA 制備核糖核蛋白復合物，加入適量蛋白酶抑制劑、DTT 和RNA 酶抑制劑，被Protein A珠子預清除1 h 后，上清均分兩部分，分別和過夜包被兔IgG 和PCBP2 抗體的Protein A 珠子4 ℃搖床孵育3 h。加入DTT 的漂洗液洗珠子4 次，取1/10 的珠子加適量上樣緩沖液，98 ℃10 min 變性后作為RIP蛋白樣品－20 ℃保存;剩余珠子按照試劑盒“兩步法”，糖原輔助醇沉RNA 過夜，70%乙醇洗沉淀2 次，10 μL DEPC 水溶解RNA，－80 ℃保存。

1.5 芯片雜交

樣品芯片雜交和數據分析均委托上海歐易生物醫學科技有限公司完成，所用芯片為Affymetrix miRNA 3.0 芯片。RNA 利用NanoDrop ND-2100 (Thermo Scientific 公司)定量并經Agilent 2100 (Agilent Technologies 公司)檢測RNA 完整性。RNA 質檢合格后，樣本的標記、芯片的雜交以及洗脫參照芯片標準流程。

1.6 數據分析

實驗組為HA、T98G 和U87MG 細胞中PCBP2抗體RIP 的樣品;對照組為這3 種細胞中兔IgG 的RIP 樣品。差異miRNA 利用t 檢驗的P 值和倍數變化值進行篩選，篩選的標準為上調倍數變化值＞4且P＜0.05。

2 結果

2.1 檢測PCBP2 蛋白在3 種細胞內的表達

應用MBL 公司的RIP 級PCBP2 抗體在HA、T98G 和U87MG 細胞中通過Western blot 檢測PCBP2 蛋白的表達，β-actin 作為上樣內參。結果顯示，該抗體可以特異地與細胞內PCBP2 兩種剪接形式結合，并且PCBP2在神經膠質瘤細胞中的總體表達水平高于正常星形膠質細胞，與實驗室前期結果一致(圖1)［6］。

圖1 PCBP2 蛋白在人星形膠質細胞(HA)和神經膠質瘤細胞系(T98G 和U87MG)中的表達水平Fig 1 Expression of PCBP2 protein levels in human astrocyte (HA)and glioma cell lines(T98G，U87MG)

2.2 檢測PCBP2 抗體RIP 實驗的質量

利用PCBP2 抗體在上述3 種細胞中進行RIP實驗，正常兔IgG 作為實驗的陰性對照，分別收集實驗組和對照組的蛋白、RNA 樣品進行質量檢測。Western blot 結果顯示:與兔IgG 相比，通過PCBP2抗體的RIP 實驗可以高效穩定地富集到目的蛋白(圖2A);利用NanoDrop ND-2100 對RNA 定量分析:HA(IgG)0.5 μg，HA(PCBP2)0.3 μg，U87MG(IgG)1 μg，U87MG(PCBP2)1 μg，T98G(IgG)1 μg，T98G(PCBP2)3 μg;利用Agilent 2100 檢測PCBP2抗體RIP 下來的RNA 完整性:HA 細胞(28S/18S =2.5，RIN = 9.4)，U87MG(28S/18S = 2.7，RIN =8.9)，T98G 細胞(28S/18S = 2.7，RIN = 9.2)(圖2B)。質檢結果符合芯片要求。

2.3 RIP-Chip 分析和PCBP2 蛋白相互作用的miRNA

本研究中使用的是Affymetrix GeneChip miRNA 3.0 芯片，該芯片覆蓋miRNA V17.0 數據庫，可以檢測153 個物種的miRNA，總探針數19913 條，其中包括人屬的1789 條成熟miRNA、1693 條miRNA 前體(pre-miRNA/stem-loop)及2336 條核仁小分子RNA(snoRNA)和卡哈爾體小分子RNA(scaRNA)。3 種細胞的芯片檢出率分別是HA(IgG 10.79%，PCBP2 17.98%)、U87MG (IgG 12.56%，PCBP2 17.24%)和T98G(IgG 11.63%，PCBP2 22.45%)。根據3 組芯片數據，最終篩選得到富集4 倍以上且P值＜0.05 的miRNA 一共105 條，包括1 條snoRNA、1條前體miRNA 和103 條成熟miRNA(表1)。另外還發現其中有15 條miRNA 序列存在PCBP2 蛋白核心識別位點(表2)。

圖2 RIP 樣品的質量檢測Fig 2 Quality control of RIP samples

表1 利用PCBP2 抗體富集與PCBP2 結合的105 條microRNATable 1 The 105 miRNAs enriched in the PCBP2 associated miRNA population over rabbit IgG

續表1

表2 包含PCBP2 核心識別位點的15 條microRNATable 2 15 microRNAs contained the core PCBP2 recognition sites

3 討論

RIP 技術是研究細胞內RNA 與蛋白結合情況的技術，是了解轉錄后調控網絡動態過程的有力工具［7］。RIP 技術下游結合芯片技術被稱為RIPChip。隨著芯片技術的發展，RIP 既可用來分析mRNA 也可以用來分析miRNA 和蛋白的相互作用，能幫助我們更高通量地了解癌癥以及其他疾病整體水平的RNA 變化［8］。

本研究的目的蛋白PCBP2 是核內不均一核糖核蛋白家族重要成員，在實驗室前期工作中通過RIP-Chip 鑒定了其在神經膠質瘤細胞中35 條mRNA 靶標，并且驗證了靶基因FHL3 受PCBP2 負調控參與膠質瘤惡性進展［6］。當時采用的是基因表達譜芯片，本次研究利用RIP 試劑盒二步法分離miRNA，可以更高效地富集80 bp 以下的RNA，結合miRNA 表達芯片，可以高通量地分析PCBP2 在細胞內結合的成熟miRNA 和前體miRNA。

通過芯片分析結果，發現PCBP2 不但可以結合胞質中的miRNA，還可以在核內與某些snoRNA 相互作用。另外，本研究還首次發現PCBP2 可以結合前體和成熟的miR-423，說明miR-423 的生成過程可能依賴PCBP2 的調控。而以前文獻報道過可以直接結合PCBP2 的miR-328［4］也在本實驗的芯片結果中。除此之外，本研究還發現14 條存在PCBP2核心識別序列的miRNA，這也暗示PCBP2 與miRNA 之間的調節作用存在多樣性:PCBP2 可以被“誘騙”直接結合某些miRNA 或者“誘騙”miRNA 與其結合進而調節該miRNA 的靶基因表達;更多的調節機制則可能是PCBP2 通過核糖核蛋白復合物或者共同的靶mRNA 與miRNA 相互作用。

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［3］Makeyev AV，Liebhaber SA．The poly(C)-binding proteins:a multiplicity of functions and a search for mechanisms［J］．RNA，2002，8:265-278．

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［8］Dahm GM，Gubin MM，Magee JD，et al．Method for the isolation and identification of mRNAs，microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using RIP-Chip［J］．J Vis Exp，2012，67:3791-3851．