二十味沉香丸增強低氧性肺動脈高壓大鼠肺組織PKC-α表達

王海燕，王 剛，張曉巖，李菊英，賀菊香，李生花

(青海大學醫學院病理教研室，青海西寧810001)

慢性高原病是青藏高原特有的常見病，表現為低氧血癥、紅細胞增生和肺動脈高壓。二十味沉香丸是根據藏醫學原理，采用天然沉香、丁香等20 味藏藥合成(藏藥名:阿嘎爾尼秀日布)，具有改善心肌缺血、肺功能等作用［1］。PKC 是信號傳導通路的重要成員，可能參與了肺動脈高壓肺血管重塑的形成。本研究旨在通過二十味沉香丸干預，觀察大鼠肺動脈壓、肺組織中PKC-α 表達水平的變化，探討PKC-α 在二十味沉香丸預防低氧性肺動脈高壓中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料:兔抗大鼠PKC-α 一抗和兔HRP 辣根過氧化物酶二抗(Genetex 公司)，β-actin 抗體和羊抗兔HRP 標記二抗(Santa Cruz 公司)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(Pierce 公司)。二十味沉香丸(青海省金珠藏藥廠)。Wistar 大鼠SPF級，雄性200 ～250g(青海省實驗動物中心，許可證號:醫動字第14-004 號)。

1.2 肺動脈高壓大鼠模型的建立和分組:將大鼠隨機分為:1)常氧對照組;2)高原低氧組;3)藥物干預組(二十味沉香丸干預)。常氧對照組在西寧(海拔2 260 m)飼養;高原低氧組和干預組(海拔4 500 m)飼養30 d。藥物干預組動物用二十味沉香丸灌胃，每天1 次。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肺動脈壓測定:LMS-2B 雙導生理記錄儀采集、分析肺動脈壓。

1.2.2 ELISA 分析各組血清中PKC-α 的含量:按試劑盒說明書操作。

1.2.3 Westem bolt 檢測PKC-α 的表達:使用PIPA 裂解液提取各組肺組織蛋白，BCA 法定量。后上樣、轉膜、封閉。兔抗鼠PKC-α 一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜。加入羊抗兔二抗(1∶5 000)。LI-COR Odyssey 成像檢測，β-actin 為內參計算相對表達量。

1.2.4 免疫組化檢測PKC-α 的表達:各組肺組織切片脫蠟、水化、抗原修復、封閉，加入兔抗鼠PKC-α 一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜。加入生物素標記二抗工作液孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片光鏡觀察。

2 結果

2.1 二十味沉香丸對肺動脈壓和血清中PKC-α 含量的影響:高原低氧組肺動脈壓顯著高于常氧對照組(P＜0.05)，經二十味沉香丸干預后肺動脈壓顯著低于高原低氧組(P＜0.05)。常氧對照組、高原低氧組、藥物干預組血清中PKC-α的含量沒有顯著性差別(表1)。

2.2 Western 法檢測肺組織中PKC-α 的表達:高原低氧組第7、15 和30 天肺組織的PKC-α 表達較第1 天低;藥物干預組較高原低氧組PKC-α 的表達沒有顯著性增高(P＜0.05)(圖1，表2)。

表1 各組肺動脈壓和血清中PKC-α 的含量Table 1 Pulmonary artery pressure and concentration of serum PKC-α in normal group，hypoxia group and treatment group(±s，n=10)

表1 各組肺動脈壓和血清中PKC-α 的含量Table 1 Pulmonary artery pressure and concentration of serum PKC-α in normal group，hypoxia group and treatment group(±s，n=10)

*P＜0.05 compared with normal group;#P＜0.05 compared with hypoxia group(1 mmHg=0.133 kPa)．

day normal grouphypoxia grouptreatment group PAP(mmHg)PKC-α(ng/mL)PAP(mmHg)PKC-α(ng/mL)PAP(mmHg)PKC-α(ng/mL)1st20 ±310.55 ±1.5118 ±2*10.40 ±1.2221 ±3#10.63 ±1.44 3rd21 ±29.28 ±2.0523 ±3*10.01 ±3.0222 ±3#10.38 ±1.65 7th21 ±310.29 ±2.0832 ±5*11.88 ±0.7425 ±3#11.30 ±1.30 15th21 ±39.79 ±1.9330 ±3*12.93 ±3.4422 ±5#12.06 ±1.52 30th22 ±310.05 ±1.6749 ±10*10.98 ±2.0527 ±4#11.45 ±0.94

圖1 肺組織中PKC-α 的表達Fig 1 Expression of PKC-α in lung tissue

2.3 用免疫組化檢測大鼠肺組織中PKC-α 的表達:藥物干預組中的PKC-α 表達較高原低氧組要強(P＜0.05)(圖2，表2)。

3 討論

二十味沉香丸是否通過調節PKC 途徑抑制肺動脈高壓?本實驗在高海拔低氧環境下成功復制大鼠肺動脈高模型。藥物干預組與高原對照組相比肺動脈壓顯著降低，提示二十味沉香散能抑制低氧引起的肺動脈高壓。高原低氧組第7、15 和30 天大鼠肺組織的PKC-α 表達較第1 天低，提示在慢性低氧環境下細胞由適應發展為損傷，PKC-α 的表達下降，大鼠肺動脈高壓形成。藥物干預組較高原低氧組PKC-α的蛋白表達顯著性增高，提示二十味沉香丸對肺動脈高壓具有抑制作用，具有保護肺功能的作用。但是ELISA 法檢測到血清中PKC-α 結果為各組沒有顯著性差別，說明PKC-α 在肺組織中的表達對低氧環境更為敏感;二十味沉香丸可能通過PKC-α 途徑發揮降低肺動脈高壓的藥效，同期研究中也發現二十味沉香丸與MAPK 通路有聯系。PKC-α 在低氧中起到保護作用可能與以下機制有關:1)PKC可能通過調節胞內游離Ca2+水平來實現保護作用。2)PKC 通過上調ATP 敏感K+通道活性防止細胞的代謝性損害［2］。3)PKC 通過下游絲裂原激活的蛋白激酶家族(MAPK)通路對細胞進行保護［3］。

表2 二十味沉香丸對大鼠肺組織PKC-α 蛋白表達的影響Table 2 Twenty flavour aloes pil influence expression of PKC-α in hypoxia group and treatment group(±s)

表2 二十味沉香丸對大鼠肺組織PKC-α 蛋白表達的影響Table 2 Twenty flavour aloes pil influence expression of PKC-α in hypoxia group and treatment group(±s)

＊P＜0.05 compared with hypoxia group．

day hypoxia grouptreatment group APKC-α/Aβ-actin(n=3)A value(n=7)APKC-α/Aβ-actin(n=3)A value(n=7)1st0.874 ±0.0320.310 ±0.0580.901 ±0.0390.363 ±0.041 7th0.717 ±0.0250.388 ±0.0931.151 ±0.030*0.330 ±0.062 15th0.692 ±0.0370.243 ±0.1441.202 ±0.045*0.373 ±0.104*30th0.631 ±0.0210.198 ±0.0771.194 ±0.037*0.395 ±0.094*

圖2 肺組織中PKC-α 的表達Fig 2 Expression of PKC-α in the lungs(×200)

本研究只是觀察到了二十味沉香丸預防低氧性肺動脈高壓機制中的部分現象，其通過PKC 途徑的具體作用靶點及機制有待更進一步的研究和探索。

［1］閆曉麗，田紅燕，劉亞．肺動脈高壓5-HT2A 鼠肺動脈中PKC、TGF-β1 的表達及受體拮抗劑對其表達的調控［J］．西安交通大學學報，2013，34:293-295．

［2］張松濤，王微，張權宇．虎杖苷通過PKC 對大鼠離體缺血再灌注心肌的保護作用［J］．心臟雜志，2010，3:48-50．

［3］Chung YW，Kim HK，Kim IY，et al．Dual function of protein kinase C (PKC)in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-induced manganese superoxide dismutase (Mn-SOD)expression:activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt，respectively［J］．J Biol Chem，2011，286:29681-29690．