羅格列酮對BIU-87膀胱癌細胞系轉移能力的影響

何 毅，李映川，章 卓

(瀘州醫學院1.附屬醫院泌尿外科;2.藥理教研室，四川瀘州646000)

膀胱癌是常見的惡性腫瘤之一，其發病率居惡性腫瘤第9位，發生機制尚不清楚，過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activatcd receptor-γ，PPAR-γ)是一種細胞內的轉錄因子，與腫瘤細胞的分化、增殖密切相關，PPAR-γ 可能與膀胱癌發生、轉移和侵襲有關［1］。羅格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物，是過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑。據此，通過羅格列酮干預后觀察BIU-87 膀胱癌細胞系的侵襲和黏附能力，可以判斷PPAR-γ 與膀胱癌體外侵襲和黏附能力的關系，為膀胱癌可能的轉移機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑:BIU-87 膀胱癌細胞系(上海拜力生物試劑有限公司);PPAR-γ 激動劑羅格列酮(浙江萬馬公司);Transwell小室(Costar Cambridge 公司);Matrigel 膠;趨化因子人纖連蛋白(BD 公司);CCK-8 試劑盒(碧云天生物技術研究所);兔抗人PPAR-γ、MMP-9 和β-actin 抗體及羊抗兔二抗(Abcam 公司)。

1.2 CCK-8 法檢測羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細胞活力影響:BIU-87 膀胱癌細胞常規培養。取5 ×105個/L 對數增殖期BIU-87 膀胱癌細胞接種到96 孔板中，24 h 后將96 孔板分為對照組、羅格列酮5、10、20、40 和80 mg/L 組，每個濃度4個復孔，處理24 h 后每孔加入CCK-8 10 μL 繼續培養1 h，酶標儀450 nm波長下檢測各孔吸光度值，以A 值反映細胞活力情況。實驗重復3 次。抑制率= (1－實驗組A 值/對照組A值)×100%。

1.3 羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細胞侵襲能力的影響:Transwell 小室4 ℃預冷，將趨化因子人纖連蛋白(fibronectin，FN)涂于小室下層，Matrigel 膠包被于小室上層，37 ℃孵育1 h。根據1.2 結果，將實驗分為對照組、羅格列酮10 和20 mg/L組。實驗步驟為先將對數生長期的BIU-87 膀胱癌細胞經羅格列酮處理24 h，對照組細胞正常培養不作處理。之后收集細胞，取5×105個/L 細胞懸浮于小室的上層，小室下方加入含0.1%牛血清蛋白的培養基600 μL，37 ℃孵育24 h。經多聚甲醛固定，HE 染色。每組4 個復孔，顯微鏡下選取5 個視野計算穿過濾膜的細胞數，計算平均值和比值。實驗重復3 次。

1.4 羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細胞黏附能力的影響:實驗分組同1.3。羅格列酮處理24 h 后，收集細胞5 ×105個/L接種在鋪有Matrigel 膠的24 孔板中，37 ℃孵育1 h，棄培養基，PBS 洗3 次，加入20 μL MTS，37 ℃孵育2 h。用酶標儀測定黏附在Matrigel 膠上細胞的A 值(波長490 nm)。

1.5 免疫印跡法檢測PPAR-γ 和MMP-9 蛋白表達:實驗處理同1.3，將細胞加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液0.5 mL冰上裂解。轉入1.5 mL 離心管中，4 ℃12 000 × g 15 min，吸取上清。采用4%濃縮膠和8%分離膠，SDS-PAGE電泳，100 V 轉膜120 min，轉膜后將硝酸纖維素膜放入封閉液中，搖床緩慢搖動，封閉1.5 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，加入二抗，孵育，洗膜。以β-actin 為內參，用圖像分析儀對條帶進行掃描。

2 結果

2.1 羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細胞活力影響:40 mg/L 以上濃度羅格列酮對細胞有嚴重不良反應(圖1)。

2.2 羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細胞黏附能力與侵襲能力的抑制作用:10 mg/L 與20 mg/L 羅格列酮使BIU-87 膀胱癌細胞黏附能力降至對照組的61.2% 和38.6% (P＜0.05)，10 和20 mg/L 羅格列酮使BIU-87 膀胱癌細胞MMP-9蛋白表達減弱(P＜0.05)，PPAR-γ 表達增強(P＜0.05)(圖2)，侵襲能力是對照組的42.3% 和21.6%(P＜0.05)(圖2)。10 和20 mg/L 羅格列酮使BIU-87 膀胱癌細胞MMP-9 蛋白表達減弱(P＜0.05)，PPAR-γ 表達增加(P＜0.05)(圖2)。

圖1 不同濃度羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細胞活力影響Fig 1 Effects of rosiglitazone on BIU-87 cells vitality

3 討論

腫瘤轉移包括腫瘤細胞脫離原發部位，穿越基質組織和血管壁，進入循環系統，形成遠端轉移。膀胱癌患者保留膀胱術后2年內復發率高達50%［2］。膀胱癌的發生、浸潤和轉移涉及多種因素，PPAR-γ 與MMP-9 都與膀胱癌該轉移有關。PPAR-γ 是一種細胞內的轉錄因子，與腫瘤細胞的分化、增殖密切相關。基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)參與了膀胱癌的轉移，MMP-9 可能通過降解包括基底膜Ⅳ型膠原在內的細胞外成分，使癌細胞向深層間質浸潤的同時也突破淋巴管和血管的基底膜而向脈管浸潤，最終發生轉移［3］。已有研究表明羅格列酮可通過激活PPAR-γ而發揮抗腫瘤作用。因此，本實驗通過羅格列酮干預，觀察PPAR-γ 表達增加后對膀胱癌細胞體外黏附能力與侵襲能力的影響，同時檢測MMP-9 蛋白表達。

實驗結果顯示，羅格列酮干預后，BIU-87 膀胱癌細胞黏附能力與侵襲能力下降明顯，證實PPAR-γ 激動后可以影響膀胱癌細胞侵襲能力和黏附能力，提示PPAR-γ 參與了膀胱癌的轉移過程。同時BIU-87 膀胱癌細胞MMP-9 蛋白表達減弱，提示羅格列酮在激動PPAR-γ 時可能對MMP-9 還存在抑制效應，對膀胱癌細胞侵襲能力和黏附能力的影響可能也與抑制MMP-9 蛋白表達有關。

綜上所述，PPAR-γ 在膀胱癌轉移中有重要價值，這為今后進一步以PPAR-γ 基因作為靶點應用于膀胱癌的治療提供了科學依據。

圖2 羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細胞黏附能力與侵襲能力的抑制作用及對MMP-9 和PPAR-γ 蛋白表達的影響Fig 2 Effect of rosiglitazone on adhesion ability and invasion ability of BIU-87 cells(n=4)and the expressions of MMP-9 and PPAR-γ(n=3)

［1］Sugiyama N，Yoneyama MS，Hatakeyama S，et al．In vivo selection of high-metastatic subline of bladder cancer cell and its characterization［J］．Oncol Res，2013，20:289-295．

［2］Kaur J，Sanyal SN．Modulation of inflammatory changes in early stages of colon cancer through activation of PPAR gamma by diclofenac［J］．Eur J Cancer Prev，2010，19:319-327．

［3］Said N，Sanchez-Carbayo M，Smith SC，et al．RhoGDI2 suppresses lung metastasis in mice by reducing tumor versican expression and macrophage infiltration［J］．J Clin Invest，2012，122:1503-1518．