氫氣能減少人肺上皮細(xì)胞系缺氧/復(fù)氧損傷后炎性因子釋放

劉軍肖，韓晨燕，付國俊

(1.河北省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北石家莊050051;2.河北省直機(jī)關(guān)第一門診部保健科，河北石家莊050051;3.滄州市人民醫(yī)院皮膚科，河北滄州061000)

肺部良好的血液循環(huán)是組織細(xì)胞攝取氧及保證細(xì)胞生存的基本條件，肺部缺血、缺氧誘發(fā)過度的炎性反應(yīng)，是肺損傷重要病理過程［1］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)氫氣具有抗炎作用，減輕缺血再灌注損傷等炎性因子過量釋放［2］。本實(shí)驗(yàn)擬探討氫氣對肺細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷后炎性反應(yīng)的影響，進(jìn)一步證明氫氣對肺細(xì)胞缺氧復(fù)氧后炎性因子的作用。

1 材料與方法

1.1 材料:BEAS-2B 人正常肺上皮細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。缺氧培養(yǎng)箱為長沙華曦電子科技有限公司生產(chǎn)的YCP-50S 三氣培養(yǎng)箱，使用99.9 % N2。ELISA 試劑盒(R＆D公司)。肺細(xì)胞系A(chǔ)549(ATCC 公司)。DMEM(Invitrogen 公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組:細(xì)胞應(yīng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合后，消化、傳代，細(xì)胞傳代3 次后，用于實(shí)驗(yàn)。富氫液的制備:將含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基置于高純氫氣環(huán)境中，0.4 MPa 壓力下加壓暴露4 h，至氫氣溶解于培養(yǎng)基達(dá)到飽和狀態(tài)，放于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)開始后，將H/R 和H/R+H2組細(xì)胞于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min，后于正常培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min。分為4 組:Con:對照組;Con +H2:對照+氫氣組;H/R:缺氧/復(fù)氧損傷組;H/R+H2:缺氧/復(fù)氧損傷+氫氣組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液備用。

1.3 檢測指標(biāo):MTT 法檢測細(xì)胞活力:將細(xì)胞接種于96 孔板，應(yīng)用MTT 和DMSO，在酶聯(lián)免疫檢測490 nm 處吸光度值。炎性因子濃度的測定:采用ELISA 法，檢測TNF-α、IL-1β 和HMGB1 濃度，嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行。用Western blot 法測定NF-κB 的表達(dá):收集細(xì)胞蛋白，進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，用NF-κB 單克隆抗體及二抗進(jìn)行孵育。然后顯色、曝光，以獲得蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，測定結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較。

2 結(jié)果

與Con 和Con+H2組相比，H/R 組缺氧/復(fù)氧后MTT 檢測細(xì)胞活力值降低(P＜0.05)，早期炎性因子TNF-α、IL-1β和NF-κB 蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，晚期炎性因子HMGB1 無明顯變化;與H/R 組缺氧/復(fù)氧損傷后相比，給予氫氣處理的H/R +H2組MTT 值明顯增加(P＜0.05)，早期炎性因子TNF-α、IL-1β 和NF-κB 蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，晚期炎性因子HMGB1 無明顯變化(圖1，2，3)。

圖1 氫氣對肺細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞活力的影響Fig 1 The effect of hydrogen on cell-activity after H/R of cell

3 討論

肺損傷導(dǎo)致的缺血對機(jī)體影響主要是由于缺血導(dǎo)致組織氧攝入不足，使細(xì)胞內(nèi)大量有害物質(zhì)聚集，如炎性因子、趨化因子等，引起細(xì)胞生長受限，甚至死亡，對機(jī)體造成不可逆轉(zhuǎn)損傷。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予肺細(xì)胞缺氧處理后，細(xì)胞生長受到明顯抑制，說明肺細(xì)胞攝入氧不足，導(dǎo)致大量有害代謝產(chǎn)物堆積，致使細(xì)胞不能正常增殖、生長。

圖2 氫氣對肺細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后NF-κB 表達(dá)的影響Fig 2 The effect of hydrogen on the NF-κB expression after H/R of cell

圖3 氫氣對肺細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后早、晚期炎性因子表達(dá)的影響Fig 3 The effect of hydrogen on the expression of early and late inflammatory factors after H/R of cell

氫氣具有抗炎作用，可以減輕多種疾病的炎性因子過量釋放。可以明顯減輕肺移植后的炎性因子釋放，對移植肺具有明顯保護(hù)作用［3］。

TNF-α 和IL-1β 作為早期炎性介質(zhì)，可迅速誘發(fā)細(xì)胞損傷、死亡，進(jìn)而引起機(jī)體損害。HMGB1 具有晚期炎性介質(zhì)作用，可以誘發(fā)有害物質(zhì)釋放，而過量的早期炎性因子可誘發(fā)HMGB1 大量釋放。NF-κB 是調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放的核轉(zhuǎn)錄因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，缺氧可誘發(fā)肺細(xì)胞釋放大量的早期炎性因子TNF-α 和IL-1β，可增強(qiáng)NF-κB 表達(dá)，對晚期炎性介質(zhì)無明顯影響。氫分子處理后，炎性因子釋放減少，NF-κB 表達(dá)減少。

綜上所述，氫氣可以減輕缺氧誘發(fā)的肺細(xì)胞炎性反應(yīng)，可以減輕早期炎性介質(zhì)的釋放，機(jī)制可能與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的表達(dá)有關(guān)。

［1］De Perrot M，Liu M，Waddell TK，et al．Ischemia-reperfusion-induced lung injury［J］．Am J Respir Crit Care Med，2003，167:490-511．

［2］Xie KL，Yu YH，Zhang ZS，et al．Hydrogen gas iproves survival rate and organ damage in zymosan-induced generalized inflammation model［J］．Shock，2010，34:495-501．

［3］Mao YF，Zheng XF，Cai JM，et al．Hydrogen-rich saline reduces lung injury induced by intestinal ischemia/reperfusion in rats［J］．Biochem Biophy Res Commun，2009，381:602-605．