新疆漢族、維吾爾族HPV16E6基因變異與子宮頸癌及宮頸病變的關系

古麗娜爾·阿不拉，朱開春，瑪依努爾·尼牙孜*，馬正海

(1.新疆維吾爾自治區人民醫院婦科，新疆烏魯木齊830001;2.新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊830046)

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，大量流行病學資料顯示，在99%以上的宮頸癌組織中存在人乳頭瘤病毒(human Papillomavirus，HPV)DNA，HPV感染是宮頸癌發生的主要并且為始動因素［1］。HPV存在100 多種亞型，其中HPV16 與宮頸癌發病密切相關［2］。HPV16 早期基因區(early region，E 區)、由6 個開放讀碼框架(open reading frame，ORF)組成，其中E6 是HPV16 主要致癌基因之一。E6 蛋白與抑癌基因P53 結合導致P53 蛋白降解以及生物學功能喪失，從而引起細胞周期紊亂，DNA 損傷積累，最終引起細胞癌變。

將世界范圍不同種族，不同人群中分離的HPV16區分為5 種主要的種系發生群［3］。有研究表明［4］，HPV16E6 基因及其編碼蛋白的變異與宮頸癌發生有關，不同地區宮頸癌組織中E6 變異株的分布不一致。前期研究指出，新疆維吾爾族婦女宮頸癌組織中HPV16E6 基因存在突變［5］，本研究在此基礎上，進一步檢測新疆漢族、維吾爾族宮頸癌及宮頸病變細胞中HPV16E6 變異株的分布，探討隨病變的加重HPV16E6 變異的變化規律及其在兩個民族間的差異。

1 材料與方法

1.1 病例收集

收集從2011年9月至2012年3月在新疆自治區人民醫院住院或門診就診的漢族、維吾爾族婦女宮頸癌及宮頸病變標本244 例進行凱普基因芯片檢測，篩選出HPVl6 陽性病例140 例(漢族65例，維吾爾族75 例)為研究對象。患者年齡22 ～78 歲，中位年齡45 歲。所有標本收集均經患者本人知情同意。

1.2 主要試劑和引物的設計和合成

TaqDNA 聚合酶、dNTP 和DNA marker DL2000(上海生工生物工程技術有限公司)根據HPV16DNA全長序列，利用primer express 軟件PE 公司設計跨HPV16E6 整個閱讀框的一對HPV16E6 P1:5'-CGT AACCGAAATCGGTTGAAC-3'，P2:5'-GCTCATAACA GTAGAGATC-3'引物，上述引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 HPV16E6 基因PCR 擴增和序列測定及分析

通過凱普基因芯片技術進行HPV 基因分型，篩選HPV16 陽性標本，用HPV16 陽性細胞DNA 為模板，擴增HPV16E6 基因，PCR 反應條件如下:95 ℃預變性5 min，94 ℃30 s，51 ℃30 s，72 ℃60 s，35個循環，72 ℃7 min。

1.4 HPV16 E6 基因測序及分析

PCR 產物純化后，利用HPV16 E6 P1/P2 引物，正反向對PCR 產物直接測序。純化和測序服務由英濰捷基生物工程有限公司提供。測序結果用DNAMAN(6 .0.3.48)軟件進行比對分析。

1.5 統計學分析

采用SPSS13.0 統計學軟件，基因突變率比較均采用χ2檢驗。

2 結果

2.2 HPV16 陽性標本中HPV16 E6 基因擴增結果

以HPV16 陽性細胞 DNA 為模板，利用跨HPV16E6 整個閱讀框引物擴增E6 基因，陽性結果在550 bp處呈現一亮帶。140 例HPV16 陽性標本中有129 例擴增出E6 基因11 例未擴增出(圖1)。

2.2 HPV16E6 基因測序結果及分析

HPV16E6 基因PCR 產物經過純化后直接進行雙向測序，得到清晰的測序結果123 份(漢族57 份、維吾爾族66 份)，另外6 個樣品信號較差，未進行突變分析。將所測序列與HPV16 標準株E6 基因序列進行比較，漢族、維吾爾族宮頸癌及宮頸病變標本HPV16E6 突變率分別為:47.37%(27/57)和50%(33/66)，兩個民族標本中共發現8 個基因突變位點:178:T→G(25:D→E)、256:T→C(同義突變)、295:T→G(64:D→E)、320:A→G(73:I→V)、335:C→T(78:H→Y)、350:T→G (83:L→V)、430:A→G(同義突變)、442:A→C(113:E→D)(數字代表堿基在HPV16 全基因序列中的位置)，E6 變異株在新疆漢族、維吾爾族中的分布以亞洲株和歐洲株為主(表1，圖2)。

圖1 HPV16E6 PCR 電泳結果圖Fig 1 PCR amplification of HPV16E6 gene

2.3 HPV16E6 突變在漢族、維吾爾族各級別宮頸病變之間的分布

發生變異的27 例漢族宮頸癌及宮頸病變標本中主要突變位點分別為178:T→G(25:D→E)、320:A→G(73:I→V)、335:C→T(78:H→Y)、350:T→G(83:L→V)、442:A→C(113:E→D)，在33 例維吾爾族宮頸癌及宮頸病變標本中，主要突變位點分別為350:T→G(83:L→V)、295:T→G(64:D→E)、178:T→G(25:D→E)、320:A→G (73:I→V)、335:C→T(78:H→Y)、442:A→C(113:E→D)，其中L83V 變異株在漢族、維吾爾族突變中占的比例均最高，漢族L83V 突變頻率為29.82%(17/57)顯著低于維吾爾族的40.90%(27/66)(P＜0.05)，而漢族D25E 突變頻率為19.30%(11/57)顯著高于維吾爾族的7.58%(5/66)(P＜0.05)。D64E 變異株在維吾爾族中突變頻率為6.1%(4/66)，而漢族標本中未檢出。E6 基因突變率隨宮頸病變的加重均具有增加趨勢，在漢族各級別宮頸病變之間無差異，在維吾爾族各級別宮頸病變之間也無差異(表2)。

3 討論

宮頸癌是嚴重威脅婦女生命健康的疾病之一，在維吾爾族人群中發病率和死亡率均較高并有年輕化趨勢。高危型HPV 持續性感染與宮頸癌發病密切相關，大多數宮頸癌組織中可檢測到HPV16 和HPV18，所以HPV16 和HPV18 感染被認為是宮頸癌的主要病因［6］。大多數研究顯示，某些特定的HPV16 變異株的感染增加宮頸病變的風險，或其感染與宮頸病變程度有關，相同的變異株在不同地區、不同種族的致癌危險性也存在明顯的差異［4］。

表1 HPV16E6 堿基及氨基酸變異Table 1 HPV16E6 nucleotide and amino acid mutation of HPV16E6

圖2 新疆漢族、維吾爾族婦女宮頸癌及宮頸病變標本HPV16E6 變異株與參考株E6 蛋白氨基酸序列比較Fig 2 The specimen mutant and reference strains of HPV16E6 amino acid sequence of cervical cancer and cervical lesions in Han，Uygur women

表2 HPV16E6 突變在漢族、維吾爾族各級別宮頸病變之間的分布Table 2 HPV16E6 mutation distribution of cervical cancer and cervical lesions in Han，Uygur

HPV 的基因變異、病毒持續和反復感染及宿主免疫狀態等因素與宮頸癌的發生密切相關，其中HPV 病毒持續和反復感染可由基因的變異所引起，所以干擾致癌基因E6 的型內變異使P53 蛋白的穩定性增強，具預防宮頸癌的作用［7］。HPV16 E6 基因常發生變異，不同地區流行的變異株也有差異。歐美地區流行的HPV16E6 變異株主要是G350(L83V)，而東亞地區主要是G178(D25E)［8］。研究發現，中國廣東地區宮頸癌中HPV16E6 突變株以D25E 為主，還有E113D、H78Y、L83V、F69L［9］。前期研究指出新疆維吾爾族宮頸癌組織中存在HPV16E6 基因突變，突變株以L83V 為主，也有D25E、D64E［5，10］。本研究中，新疆漢族、維吾爾族宮頸癌及宮頸病變標本中HPV16E6 變異株均以L83V為主，漢族L83V 突變頻率顯著低于維吾爾族中的突變頻率，還存在D25E、I73V、D64E、H78Y、E113D的變異株，漢族D25E 突變頻率顯著高于維吾爾族，漢族標本中未發現D64E 變異株，同時本組漢族、維吾爾族婦女宮頸癌及宮頸病變標本中還存在非洲亞型H78Y 變異株和亞洲亞型E113D，這在前期文獻中未報道。在我國新疆地區除了有亞洲型E6 突變外，還有歐洲型和非洲型突變類型，這可能與新疆漢族、維吾爾族種族特異性有關。

目前HPV16 基因突變與宮頸癌的相關性報道，國外研究結論不一，國內報道較少。有研究報道，HPV16 基因350 位T 到G 的突變是宮頸癌的高危因素［11］。本研究結果顯示，350 nt、178 nt等位點的E6 基因突變率在兩個民族中隨宮頸病變的加重均具有增加趨勢，但無顯著性差異。此結果與一些研究結果不一致［12］。

本研究結果提示，在新疆漢族、維吾爾族婦女宮頸癌及宮頸病變標本中均存在較多的HPV16E6變異株，各變異株在兩個民族病樣中的分布有差異，維吾爾族標本中L83V 變異株比漢族多并隨病變的加重具增加趨勢，漢族標本中檢出的D25E 變異株多于維吾爾族，漢族標本中未發現D64E 變異株，可能是維吾爾族特異變異株，此結果將為我國不同民族宮頸癌及宮頸病變患者組織中HPV16E6基因變異特點積累流行病學資料，對闡明該區宮頸癌高發原因有一定的意義。

［1］Patricia Dhar J，Lancaster W，Gregoire L，et al．HPV cervical infection and immunodysregulation:synergistic risks for neoplasia-review［J］．Current Women's Health Reviews，2010，6:287－296．

［2］Whyte J．HPV and cervical cancer:Latest developments［J］，Consultant，2012，52:555－560．

［3］Yamada T，Manos MM，Peto J，et al．HPV 16 sequence variation in cervical cancers:a worldwide Perspective［J］．J Viol，1997，71:2463－2472．

［4］Zehbe I，Richard Ch，Decarlo CA，et al．Human papillomavirus 16E6 variants differ in their dysregulation of human keratinocyte differentiation and apoptosis［J］．Virology，2009，383:69－77．

［5］朱開春，瑪依努爾·尼牙孜，劉芳，等．新疆維吾爾族婦女宮頸癌組織HPV16 型E6 基因的變異分析［J］．臨床腫瘤學雜志，2008，13:209－212．

［6］曾四元，梁美蓉，李隆玉，等．血清SCCA 水平及盆腔淋巴結HPV16/18 感染狀況與宮頸鱗癌患者預后的關系［J］．基礎醫學與臨床，2012，32:1167－1170．

［7］李晶華，王偉娟，高婉麗，等．HPV18E6siRNA 對宮頸癌細胞增殖及化療藥物敏感性的影響［J］．基礎醫學與臨床，2010，30:500－504．

［8］Revilla RL，Pineda MA，Valdez JO，et al．Human papillomavirus type16 variants in cervical intraepithelial neoplasia and invasive carcinoma in San Luis Potosi City，Mexico［J］．Infectious Agents and Cancer，2009，4:1－9．

［9］Cai HB，Chen CC，Ding XH，et al．Human papillomavirus types 16E6 gene variations in Chineses population［J］．EJSO，2010，36:160－163．

［10］馬正海，張富春，梅新娣，等．新疆維吾爾族婦女宮頸癌組織中HPV16 E6 基因的突變分析［J］．癌癥，2004，23:10－16．

［11］Zuna RE，Moore WE，Shanesmith RP，et al．Association of HPV16E6 variants with diagnostic severity in cervical cytology samples of 354 women in a US population［J］．Int．J．Cancer，2009，125:2609－2613．

［12］李清陽，瑪依努爾·尼牙孜，阿不力孜，等．新疆南部維吾爾族HPV16E6、E7 突變與宮頸癌、癌前病變的相關性研究［J］．新疆醫學，2009，5:1－4．